Fra-2基因在喉鳞状细胞癌中的表达研究

张云龙，宋晓飞，段云静，赵辉明，赵瑞力

(1.石家庄市第一医院 重症医学科三病区，河北 石家庄050011；2.河北省人民医院 耳鼻喉科；3.石家庄市第一医院 耳鼻喉科；4.河北医科大学第四医院 耳鼻喉科)

喉癌是耳鼻咽喉-头颈外科常见的恶性肿瘤，其中以鳞状细胞癌最为多见。有关喉癌发生机制至今尚不清楚。随着分子生物学领域的不断进展，癌基因激活和抗癌基因失活在致喉癌病因研究中备受关注。Fra-2属原癌基因，一定条件下，可被激活转变为癌基因，发挥致细胞恶性转化的功能。先前研究显示，永生化的恶性角质上皮细胞高表达磷酸化的Fra-2[1]。近年研究显示，在乳腺癌、子宫内膜癌等多系统肿瘤中均可检测到Fra-2基因的高表达[2]，而这种基因在喉鳞状细胞癌(LSCC)中的研究尚未见报道。本研究通过免疫组化及RT-PCR法对Fra-2基因在喉鳞状细胞癌以及癌旁正常组织当中的表达情况，进一步研究它在癌组织当中表达与各临床病理参数之间的关系。

1 材料与方法

1.1材料

本院2012至2015年间行喉癌切除术患者的标本，取喉鳞状细胞癌标本47例，对应的癌旁正常组织21例。严格按照实验设计及评定标准分组(表1)：病理分级组中，高分化包括G1和G2，低分化为G3；临床分期组主要基于(UICC)TNM分类标准；在淋巴结分组当中，N+代表出现淋巴结转移的患者，N0代表未出现淋巴结转移的患者；吸烟组当中，烟龄(年)与每日吸烟量(支)乘积大于等于四百为阳性，小于四百为阴性；解剖分区组则根据肿瘤的生长范围分成声门上区及声门区。

1.2方法

免疫组化SP法按试剂盒说明操作。Fra-2 鼠抗人单克隆抗体Sc-166102购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司。二抗免疫组化试剂盒型号(SP-9002)以及DAB液ZLI-9032购自北京中杉金桥生物技术公司。RT-PCR方法：严格按照试剂盒说明书步骤进行，将组织提取并检测RNA后，反转录为cDNA，后行扩增，将最终产物放入凝胶行电泳完毕后摄像观察。RNA提取所用TRIzol 购自美国SBS公司，RT-PCR 试剂盒购自美国Promega公司，DNA Maker 购自北京索来宝科技有限公司，PCR 引物购自上海生工生物工程有限公司， Fra-2上游引物(5’→3’)GAAGAGGAGGAGAAGCGTCG,下游引物(5’→3’)CTCGGGGCTAATCTTGCACA。GAPDH为内参照，上游引物(5’→3’)AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG,下游引物(5’→3’)AGGGGTCATTGATGGCAACA。

1.3结果判定

免疫组化结果评分方法[3]：将染色强度 (intensity，I)及阳性细胞百分率(percentage，P) 均分级评分。最终组织学评分(histologiescore，H)=I×P。结果： 0-3分为低表达，4-6分为中度表达，7-9分为高表达。其中，低表达计为阴性，中表达以及高表达计为阳性。RT-PCR主要使用的软件为Gel work-2ID行结果分析，其中使用的参数为目的基因电泳图像当中条带光密度值分别除以GAPDH所对应的光密度值，所得数值代表的是基因相对表达强度。

1.4统计方法

2 结 果

2.1免疫组化结果

Fra-2蛋白阳性染色呈棕色，片状或弥漫性分布于细胞核、细胞浆(图1)。癌组织中表达阳性率70.2%(33/47)，癌旁组织中为 33.3%(7/21)。两者之间存在的统计学差异显著(χ2=8.150，P<0.05)(表2)。取喉鳞癌组织分析Fra-2基因蛋白表达和多个临床病理参数中组差异具体参见表1， Fra-2基因蛋白表达在临床分期组和淋巴结转移组中经统计分析存在差异显著(P<0.05)，吸烟组对比分析差异非常显著(P<0.01)；然而却在病理分级、患者年龄、解剖分区组内对比无差异(P>0.05)。

A为癌旁正常组织(×400)，B为喉鳞癌组织(×400)图1 免疫组化Fra-2基因在癌旁正常组织及喉鳞癌组织中表达表1 喉鳞癌组织中Fra-2蛋白和mRNA在各临床病理参数组中表达

临床参数nFra-2蛋白例(%)PmRNA(x—±s)P病理分级 G1+G23725(67.6)0.7000.33±0.330.001 G3108(80.0)0.75±0.41临床分期 Ⅰ+Ⅱ189(50.0)0.0170.35±0.390.368 Ⅲ+Ⅳ2924(82.8)0.46±0.38淋巴结转移 N+2622(84.6)0.0160.51±0.430.450 N02111(52.4)0.30±0.30吸烟 阳性3832(84.2)0.0000.45±0.410.246 阴性91(11.1)0.28±0.23年龄/岁 <60159(60.0)0.3240.31±0.330.214 ≥603224(75.0)0.47±0.41解剖分区 声门上区2117(81.0)0.1480.40±0.410.792 声门区2616(61.5)0.43±0.38

表2 喉鳞癌及癌旁正常组织中Fra-2蛋白和mRNA的表达

2.2RT-PCR检测结果

Fra-2 mRNA 在喉鳞状细胞癌以及癌旁组织当中的表达具体参见图2，表达量分别为(0.42±0.39)、(0.07±0.06)，两者对比分析差异非常显著(P<0.01)(表2)。癌组织中，Fra-2基因mRNA 表达在多个临床病理参数组别中的对比分析结果见表1。表中呈现的Fra-2基因mRNA表达仅在病理分级组中差异非常显著(P<0.01)，而其他组中(临床分期、淋巴结转移、患者年龄、吸烟习惯、解剖分区)差异无意义(P>0.05)。

图2喉鳞癌及癌旁组织中Fra-2mRNA水平表达电泳图像，其中单数(1、3、5、7)为喉鳞癌电泳图，双数(2、4、6、8)为癌旁正常组织电泳图

3 讨论

Fra-2基因为转录因子AP-1(activator protein 1)家族中Fos 亚家族中的成员[2]。可激活EGF-R、PI3K和MAPK等信号通路并通过多种途径诱导细胞增殖、凋亡抑制[4]。

本实验发现Fra-2的蛋白和mRNA水平在喉鳞癌组织中的表达均高于癌旁组织，统计学分析差异有非常显著意义。提示Fra-2均参与了肿瘤的发生、发展。Risto[4]等在对前列腺癌PC-3和DU-145两个细胞系进行培养、辐射、增殖等试验研究时，发现Fra-2通过非独立因素激活PI3K通路促进细胞增殖能力增强。另有研究示，AP1家族中的Fra-2基因，可促进MAPK磷酸化从而活化此通路，继而发挥激活目标基因启动子增加细胞转录功能[5]。这些实验表明Fra-2具有促进细胞增殖、恶性转化潜力。

关于Fra-2基因在LSCC组织蛋白水平中的表达，在淋巴结转移方面(相比于N0组来说，N+组显著更高)，临床分期方面(相比Ⅰ、Ⅱ期患者来说，Ⅲ、Ⅳ期患者显著更高)，吸烟习惯方面(相比于阴性组患者来说，阳性组患者显著更高)，差异均存在显著或非常显著统计学意义。在 mRNA水平方面只有病理分级(低分化组高于高、中分化组)，差异对比分析有非常显著统计学意义。临床参数中淋巴结转移、吸烟、年龄，组内对比差异均无统计学意义。Wang JunFeng等[6]选取人肺癌A549细胞系，通过细胞转染、免疫组化、Western blotting、qRT-PCR等技术行实验分析，证明Fra-2通过与Smad3相互作用促进TGF-b1诱导的非小细胞肺癌细胞转移。Tomonori Higuchi等[7]运用基因敲除技术证实，Fra-2/Jund异源二聚体可结合SOX4的AP-1位点，促进基因表达增加，进而促进成人T细胞淋巴瘤发展。以上结论与我们研究结论(淋巴结转移组的蛋白水平相比于无淋巴结转移组来说显著更高，临床分期中处于Ⅲ、Ⅳ期的患者，其蛋白水平相比于Ⅰ、Ⅱ期的患者来说显著更高)相同。有关Fra-2基因吸烟阳性组表达相比于吸烟阴性组来说显著更高，Erin Gensch等[8]研究发现香烟烟雾可使EGFR-JNK/ERK通路磷酸化，进而活化JunD/Fra-2异源二聚体，促进下游MUC5AC表达增多。而Zhang ziqiang[9]等通过质粒转染肺腺癌细胞系，行Real-time quantitative PCR及Western blot分析，结果MUC5A表达增多者，肺腺癌转移能力增强。综合研究结果表明吸烟烟雾可通过激活Fra-2的上下游通路促进恶性细胞转移。Shilpi Gupta等[10]通过对舌癌组织、癌前病变组织、正常舌组织、舌癌细胞株分别进行RT-PCR 及Western blotting实验分析，与舌癌前病变及正常舌组织相比，舌癌组织及舌癌细胞株有较高的c-fos/Fra-2转录水平，并证明此异源二聚体过多表达可促进舌组织细胞异型性增加。此结论与我们研究的(mRNA水平仅病理分级低分化组高于高、中分化组)吻合。以上文献报道显示，Fra-2基因可通过间接或与其他因子结合形成异源二聚体共同作用促进肿瘤发生、恶化及转移能力。

Fra-2作为原癌基因，在恶性肿瘤中的作用越来越受到关注。本实验研究，喉鳞癌组织中Fra-2 基因的表达显著增高，并通过对比多种临床参数分析此基因活化表达增多可通过多种途径参与喉癌的发生、发展，检测喉癌组织中Fra-2的表达水平对喉癌的早期诊断及为分子生物学靶向治疗提供重要参考价值。