持续压力对离体培养兔椎体终板内Wnt/β—catenin信号通路及VEGF的影响

展嘉文 冯敏山 王尚全 朱立国 韩涛 尹逊路 魏戌

[摘要] 目的 研究持续压力对椎体终板内血管内皮生长因子（VEGF）及β-catenin表达的影响，进一步探讨VEGF与椎间盘退变之间的分子作用机制。 方法 将16只新西兰白兔处死后在无菌条件下取出脊柱运动节段，随机分为对照组与压力组，每组各8只，均放入离体加载和培养装置中进行培养，其中压力组予持续3 kg压力，对照组不予压力，于培养前及培养3、7及14 d时，两组各取10个样本，应用免疫组化、Western blot、Real-time PCR检测VEGF及β-catenin的表达情况。 结果 免疫组化检测结果显示，持续压力下培养7 d时，终板内VEGF强度显著下降（0.182±0.063），与对照组（0.237±0.051）比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；培养14 d时染色强度进一步降低，压力组（0.156±0.035）与对照组（0.211±0.038）比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；相反，持续压力上调了终板内β-catenin的表達，培养期间与对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。Western blot结果显示，压力组与培养前及对照组比较，上调了β-catenin的表达，差异均有统计学意义（P < 0.05）。Real-time PCR结果显示，持续压力导致VEGF基因相对表达量减少（0.842±0.002），与对照组（0.965±0.005）比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 持续压力导致离体培养兔脊柱运动节段内椎体终板VEGF表达下降、β-catenin表达上调，提示持续压力可能通过Wnt/β-catenin信号通路调节椎体终板内VEGF表达。

[关键词] 椎体终板；血管内皮生长因子；Wnt/β-catenin；持续压力；椎间盘退变

[中图分类号] R681.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（c）-0004-05

[Abstract] Objective To study the effect of consistence pressure on the expression of VEGF and beta -catenin in vertebral endplate， and further explore the molecular mechanism between VEGF and intervertebral disc degeneration. Methods A total of 16 New Zealand rabbits were sacrificed after removed under sterile conditions in the spinal motion segment， were randomly divided into control group and pressure group（8 rabbits in each group）. Rabbits were placed in vitro loading and culture device for culture， in which the pressure group were treated with consistence pressure 3 kg， the control group did not under pressure， pro-culture and 3， 7， 14 d after culture， 10 samples were collected from each group， the expression of VEGF and beta-catenin were detected by immunohistochemistry （IHC）， Western blot and Real time-PCR. Results IHC staining showed that the VEGF staining intensity in the endplate under pressure 7 d after cultured decreased significantly（0.182±0.063）， compared with the control group（0.237±0.051）， the difference was statistically significant （P < 0.05）； the staining intensity was further decreased at 14 d after culture （0.156±0.035）， compared with the control group （0.211±0.038）， the difference was statistically significant（P < 0.05）. On the contrary， the consistence pressure increased the expression of beta-catenin in the endplate， and compared with that of the control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Western blot results showed that compared with fresh specimen and control group， consistence pressure significantly increased the expression of beta-catenin， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Real-time PCR results showed the relative expression of VEGF gene was reduced by consistence pressure（0.842±0.002）， and the difference was significant compared with the control group （0.965±0.005， P < 0.05）. Conclusion Consistence pressure leads to a decrease of VEGF expression and an increase of the expression of beta-catenin in the vertebral endplate of spinal motion segment， which suggests that continuous pressure may regulate the expression of VEGF in the vertebral endplate through the Wnt/beta-catenin signaling pathway.

[Key words] Vertebral endplate； VEGF； Wnt/ beta-catenin； Consistence pressure； Intervertebral disc degeneration

椎体终板是椎间盘营养供应的重要途径[1]，软骨细胞是软骨终板内的唯一细胞类型，其功能受到多种细胞因子的调节，其中血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）与终板内血管新生及椎间盘退变关系密切[2-3]。但VEGF在退变中的作用仍存在争议[4]，探明VEGF与椎间盘退变之间的分子作用机制，将对相关疾病的治疗产生重要意义。本实验前期研究证实持续压力诱导椎间盘退变的机制与Wnt/β-catenin信号通路有关[5]，而相关文献报道该通路对VEGFs也具有调控作用[6-7]。据此，本研究应用离体培养兔脊柱运动节段压力退变模型，观察持续压力对椎体终板内血管及相关细胞因子的影响，以进一步阐述VEGF与椎间盘退变之间的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

ABI7900HT实时定量PCR仪（美国ABI公司）、BioSens SC 810B凝胶成像仪（上海山富科学仪器有限公司）、BC-subMIDI电泳仪（北京六一仪器厂）、Beckman Allgre 21R高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；qPCR试剂盒（美国KAPA Biosystems公司）、Trizol（美国invitroge公司）、引物（上海生工生物工程公司）、胎牛血清（美国Gibco公司）、DMEM/F12培养基（美国Gibco公司）。

1.2 实验动物

健康新西蘭兔16只，4～6月龄，雌雄不限，2.5～3 kg（中国中医科学院实验动物中心提供，合格证号：2014 1002）。

1.3 实验方法及步骤

1.3.1 取材及培养 根据随机数字表法将16只实验新西兰兔分为压力组与空白对照组，每组各8只。新西兰兔麻醉后，耳缘静脉给予肝素钠，5 min后空气栓塞处死，带入超净工作台；立即在无菌条件下自背部纵切口，自尾部完整取出腰段及下位胸段脊柱，入高渗肝素磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗；在2.5倍放大镜下应用咬骨钳、手术刀片切取T12/L1、L2/L3、L4/L5、L6/S1脊柱运动节段，共4节段。自相邻椎间盘的椎体与骨性终板结合处锐性分离，得到完整脊柱运动节段，包括髓核（NP）、纤维环（AF）及上下软骨终板（EP）及相邻椎体（VB）；用带有18号针头的无菌注射器吸取含肝素的高渗PBS液冲洗标本表面的碎屑及终板上的血凝块，于含肝素的平衡盐溶液（HBSS）液（含1000 U/mL青霉素，1 mg/mL链霉素）中漂洗2 min。

两组样本放入研制的脊柱运动节段离体加载和培养装置中，压力组予3 kg压力，对照组不予负荷。两组均予细胞培养液DMEM，含有10%胎牛血清、25 μg/mL抗坏血酸、50 mg/mL庆大霉素，并用NaCl将细胞培养液的渗透压调整到410 mOsm/kg[8]。

两组均置于5% CO2、37℃恒温培养箱进行整体培养，每2天更换培养液。分别在培养前（0 d）和培养后第3、7、14天时，取出标本并沿软骨终板表面下2 mm处分离出椎体终板。

1.3.2 免疫组织化学检测 椎间盘组织常规石蜡包埋，切片，脱蜡，水化，PBS冲洗5 min×3次；热修复法进行抗原修复；山羊血清封闭5 min，加入一抗（Sigma-Aldrich，瑞士），4℃过夜；PBS清洗5 min×3次；加入二抗（Sigma-Aldrich，瑞士），室温孵育20 min，PBS清洗5 min×3次；滴加DAB（Sigma-Aldrich，瑞士）显色，约3 min，PBS清洗；苏木精复染30 s；梯度酒精脱水干燥，中性树胶封片后置于显微镜（Nikon，TS100，日本，×100）下观察VEGF及β-catenin的表达情况。

1.3.3 Western blot法检测VEGF及β-catenin的表达 收集各时间点椎体终板，加入适量裂解液，样品置于冰上以30%振幅超声，工作3 s后间歇暂停2 s，每个样品累积超声约30 s，12000 r/min离心15 min后吸取上层总蛋白溶液。BCA法测定蛋白浓度，等量分装后以上样缓冲液煮沸变性。SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，5% BSA封闭1 h，相应一抗孵育过夜，TBST洗膜，二抗孵育1 h，TBST洗膜，ECL试剂检测蛋白表达，计算机图像分析仪测定灰度值。

1.3.4 Real-time PCR检测VEGF及β-catenin的表达情况 收集各时间点椎体终板，加入适量Trizol裂解液，将样品置于冰上以30%振幅超声，工作3 s后间歇暂停2 s，每个样品累积超声约30 s。随后陆续以氯仿、异丙醇、酒精等试剂对总RNA进行提取，并测定RNA的浓度；用反转录试剂盒（KAPA Biosystem，美国）将RNA反转录为cDNA，然后以cDNA第1链作为模板行PCR扩增，PCR反应体系：Nuclease-Free Water 1.6 μL，GoScriptTM5×Reaction Buffer 4 μL，MgCl2 2 μL，PCR Nucleotide Mix 1 μL，Recombinant RNasin Ribonulease Inhibitor 0.4 μL，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，32个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像系统软件测定灰度值并计算相对强度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析，时间因素单独效应分析采用重复测量方差分析；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测椎体终板中VEGF与β-catenin表达

免疫组化法检测椎体终板中VEGF显示：压力组培养3 d时与培养前标本相比明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05），但与对照组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）；培养7 d时与对照组相比明显下降，培养14 d时强度进一步降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。而β-catenin免疫组化法检测却显示：压力组培养14 d时强度明显加深。与培养前标本比较，持续压力上调了终板内β-catenin的表达（P < 0.05），培养期间与对照组同时间点比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.2 Western blot检测椎体终板中β-catenin表达

与培养前标本比较，持续压力上调了终板中β-catenin的表达，且随着培养时间延长，表达逐渐增强，培养期间与对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.3 RT-PCR检测椎体终板中VEGF的表达

RT-PCR检测VEGF基因表达，与培养前比较，对照组3 d时VEGF表达水平无明显下降，差异无统计学意义（P > 0.05）；培养至14 d时VEGF表达水平较培养前明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），但培养期间差異无统计学意义（P > 0.05）；压力组培养期间VEGF表达明显下降，差异均有统计学意义（P < 0.05）；各时间点两组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

椎体终板是椎间盘营养供应的重要途径，终板内的血管芽是椎间盘营养物质交换的结构基础[9-10]，其破坏将造成椎间盘营养障碍，导致椎间盘退变。相关文献报道持续压力可使终板下血管分布减少造成营养障碍[11-12]，但异常应力导致终板内血管损伤的机制仍缺乏深入研究。

3.1 持续压力负荷对椎体终板内VEGF的影响

终板内的软骨细胞受到多种细胞因子的调节，其中VEGF与终板内血管新生及椎间盘退变关系密切[13-14]。VEGF可由许多正常细胞产生和分泌，主要通过旁分泌途径作用于内皮细胞[15]。通过一系列信号传导使内皮细胞分裂、增殖、迁移，形成新生血管，建立侧支循环，增加缺氧、缺血组织的氧供、血供，从而减轻或逆转细胞的受损，改善器官功能等多种功能[15]。软骨细胞是终板中VEGF的重要来源细胞，VEGF的表达上调可促进终板下毛细血管生成，维持终板下血管袢的数量，延缓椎体终板退变，从而保证椎间盘的营养供应[16]。

相关前期研究发现[17-18]，持续的静态加载会逐渐抑制椎间盘的细胞合成代谢活力，破坏椎体终板内营养通道、造成椎间盘营养供应障碍，进而引发椎间盘退变。在此基础上，本研究从分子作用水平进一步阐述异常应力导致椎间盘营养障碍诱发其退变的发生机制。实验结果提示，持续压力导致离体培养兔脊柱运动节段椎体终板内VEGF表达减少，提示VEGF参与了椎间盘压力退变过程，其在退变的发病过程中可能起着重要作用。

3.2持续压力负荷对椎体终板内Wnt/β-catenin信号通路的影响

Wnt信号通路调控网络在椎间盘的形成、生长、退变和修复的过程中起着十分重要的作用[19]。Wnt/β-catenin信号过度激活，将引起严重的椎体软骨终板细胞破坏、纤维环细胞层状结构的紊乱和髓核细胞蛋白多糖的减少，引起椎间盘结构的变形[20]。终板软骨细胞对Wnt信号通路非常敏感[20]，并可引起不可逆的退变。但同时也有研究发现抑制Wnt信号通路会导致软骨终板和类软骨细胞发生不同程度的生长性损伤，Wnt/β-catenin信号通路的适度活化对上述椎间盘组织的生长发育以及功能起着不可或缺的作用。正确地控制Wnt通路对于建立椎间盘组织和促进椎间盘组织的生长有重要的意义[21-22]。

实验前期研究发现适量的压力负荷短期内刺激了椎间盘表达分泌Ⅱ型胶原，且有利于防止组织膨胀和保持细胞活性，但持续的静态加载会逐渐抑制细胞的合成代谢活力，尤其对蛋白多糖的影响较为明显，从而造成了椎间盘退变[23-24]，而初步试验结果显示持续压力诱导退变的机制与Wnt/β-catenin信号通路密切相关。

3.3 Wnt/β-Catenin信号通路与VEGF

通过Wnt/β-catenin经典途径，能够促进血管内皮细胞的增殖、血管芽生与血管丛重塑，以促进组织的修复与愈合[25-26]。当Wnt信号通路被激活后，糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）蛋白的活性受到抑制，从而抑制了β-catenin的降解，使其在细胞质中大量聚集，并与转录因子T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）家族结合，转移至细胞核内，激活下游靶基因VEGF转录。大量研究证实β-catenin和VEGF具有明显的相关性[26-28]，但在终板软骨组织中Wnt/β-catenin通路是否对VEGF具有调控作用鲜见报道。

本研究结果显示在持续压力状态下，随着离体培养时间延长，模型椎体终板内VEGF表达逐渐下降，而β-catenin持续上调，提示β-catenin表达与VEGF表达存在相关性。基于此研究结果及文献报道，研究者推测在椎体终板组织中Wnt/β-catenin通路对VEGF具有调控作用，还将深入研究椎体终板组织中Wnt/β-catenin信号通路对VEGF的具体调控机制。

[参考文献]

[1] 曹旺烽，陈长贤.椎间盘软骨终板退变的研究进展[J].中国中医骨伤科杂志，2016，24（10）：70-74.

[2] 吕存贤，吴永琴.补阳还五汤对兔退变椎间盘中软骨终板血管芽的影响及意义[J].海峡药学，2012，24（2）：33-34.

[3] 张巍，徐宏光，俞云飞.短时间机械循环压力对3D培养脊柱终板软骨细胞的影响[J].皖南医学院学报，2015，（1）：17-20.

[4] 徐坤林，姜宏，刘锦涛.破裂型椎间盘突出动物模型中新生血管因子与炎性反应的研究[J].颈腰痛杂志，2009，30（4）：310-312.

[5] 朱立国，张平，宋庆慧，等.补肾活血方对沙鼠增龄过程中腰椎软骨终板钙化干预作用的初步研究[J].中国骨伤，2017，30（10）：926-932.

[6] 刘宣，王炎，李丹光，等.丹参酮ⅡA对COX-2激活Wnt/β-catenin信号通路介导的人肠癌细胞VEGF表达的调控作用[J].中华中医药杂志，2013，（1）：108-112.

[7] Han D，Cao C，Su Y，et al. Ginkgo biloba exocarp extracts inhibits angiogenesis and its effects on Wnt/β-catenin-VEGF signaling pathway in Lewis lung cancer [J]. J Ethnopharmacol，2016，192：406-412.

[8] Risbud MV，Izzo MW，Adams CS，et al. An organ culture system for the study of the nucleus pulposus： description of the system and evaluation of the cells [J]. Spine，2003， 28（24）：2652-2658.

[9] 彭城，任先军，梅芳瑞.椎间盘退变与终板内微血管形态改变的相关性研究[J].中国矫形外科杂志，2003，11（19）：1355-1357.

[10] 徐鸿明，胡斐，王雍立，等.兔椎体软骨终板内血管三维影像结构研究[J].中国脊柱脊髓杂志，2015，25（11）：1013-1017.

[11] 芮泽，张宁，胡志毅，等.持续性压力促进成骨细胞分泌VEGF的机制[J].南京医科大学学报：自然科学版，2011，（7）：1002-1006.

[12] 孙旗，柳根哲，贾育松，等.不同静水压对兔椎体终板软骨细胞相关基因表达的影响[J].中国矫形外科杂志，2014， 22（8）：753-757.

[13] 张小海，徐宏光，吴天亮.椎间盘退变与生物力学[J].国际骨科学杂志，2010，31（3）：137-138.

[14] 彭宝淦，贾连顺，施杞，等.软骨终板钙化在椎间盘退变过程中的作用机理[J].中国矫形外科杂志，2000，7（2）：40-43.

[15] 王拥军，施杞，周重建，等.益气化瘀方对大鼠颈椎间盘软骨终板内血管的影响[J].中国中医骨伤科杂志，2002， 10（4）：3-6.

[16] 沈颉.血管内皮生长因子（VEGF）在血管外膜成纤维细胞的表达研究[J].当代医学，2012，18（24）：24-26.

[17] Zhu LG，Feng MS，Zhan JW，et al. Effect of Static Load on the Nucleus Pulposus of Rabbit Intervertebral Disc Motion Segment in Ex vivo Organ Culture [J]. Chin Med J，2016，129（19）：2338-2346.

[18] 郭玉生，冯若琳，翁亚菡，等.不同临床分期的子宫内膜癌患者血清VEGF、CRP水平变化情况及相关性研究[J].成都医学院学报，2018，（1）：68-70，105.

[19] 梁广胜，殷明，刘玉亮，等.Wnt信号通路与椎间盘的发展[J].中国矫形外科杂志，2014，22（5）：441-444.

[20] 任东成，丁金勇.终板软骨细胞退变相关信号通路的研究进展[J].中国脊柱脊髓杂志，2017，27（7）：657-662.

[21] 陈志刚，吕书军，张建平，等.β连环素在腰椎间盘退变组织中的表达及意义[J].江苏医药，2015，41（4）：408-410.

[22] 廖军，谢巧瑜，张乐，等.电针对颈椎病模型大鼠椎间盘纤维环细胞Wnt-β-catenin信号通路的影响[J].中国针灸，2014，35（12）：1203-1207.

[23] 冯敏山，展嘉文，朱立国，等.体外培养条件下兔脊柱运动节段髓核组织的变化[J].中国组织工程研究，2015， 19（51）：8241-8246.

[24] 朱立国，展嘉文，冯敏山，等.兔椎间盘器官与脊柱运动节段离体培养条件下髓核组织的变化[J].中国骨伤，2015， 28（9）：824-831.

[25] Easwaran V，Lee SH，Inge L，et al. β-Catenin Regulates Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Colon Cancer [J]. Cancer Res，2003，63（12）：3145.

[26] 程华，孙芳玲，艾厚喜，等.Wnt信号通路与血管发生研究进展[J].神经药理学报，2011，1（6）：60-63.

[27] 江华基，江小成，贺飞林，等.黄芩素通过WNT/β-catenin信號通路促进大鼠腱骨愈合[J].分子影像学杂志，2016， 39（3）：297-301.

[28] 余文珍，陈实，张永亮，等.活血化瘀法对鼠颈动脉粥样硬化损伤血管wnt/β-catenin信号通路的影响[J].世界中医药，2016，11（3）：498-501.