低氧预处理人胎盘绒毛膜间充质干细胞环状RNA筛选

孙逊沙 吴洁莹 陈劲松 陆琰 喻秋霞 李茹 王丹 李焱 吴韶清

[摘要] 目的 探讨环状RNA在人胎盘绒毛膜间充质干细胞低氧预处理和常氧培养中表达谱的差异。 方法 利用芯片技术检测3例低氧预处理人胎盘绒毛膜间充质干细胞及其相应对照的常氧培养细胞的环状RNA表达，分析两者差异表达的环状RNA及其结合miRNA。 结果 在检测的13 617条环状RNA中，有分析结果的环状RNA 12 114条，低氧和常氧培养人胎盘间充质干细胞差异表达环状RNA共102条，其中低氧中表达上调的85条，下调的17条（倍数变化>1.5倍且P < 0.05），而表达差异倍数变化大于2倍以上的环状RNA有27条，且均为上调表达。每个环状RNA预测到5个结合miRNA。 结论 低氧预处理使得人胎盘绒毛膜间充质干细胞的环状RNA表达谱发生了显著变化，这些环状RNA可能和低氧预处理有关。

[关键词] 低氧；人胎盘绒毛膜间充质干细胞；环状RNA；表达谱

[中图分类号] R394.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（c）-0009-03

[Abstract] Objective To analyze the expression profile variation of circular RNA （circRNA） between hypoxia preconditioned human placenta chorionic mesenchymal stem cells （H-hpcMSCs） and normoxic preconditioned hpcMSCs （N-hpcMSCs）. Methods Human circRNA microarray was performed to detect the difference of circRNA expression between 3 paired specimens of H-hpcMSCs and its N-hpcMSCs. The circRNA differental expression and the predicted miRNA of differentially expressed circRNA were analyzed. Results Of the 13 617 circRNAs， 12 114 circRNAs with analytical results. In H-hpcMSCs， a total of 102 circRNAs showed differentially expressed which have more than 1.5 times variation and significant difference （P < 0.05）. Among them， 85 increased and change′s fold more than 1.5 times， while 17 reduced and change′s fold more than 1.5 times， a total of 27 circRNAs showed a greater than 2-fold change and all were up-regulated. Five miRNAs of each with differentially expressed circRNA were predicted according to specific base pairing. Conclusion The circRNA expression profile of H-hpcMSCs changed significantly in comparison with N-hpcMSCs， the circRNA may be associated with the hypoxia precondition.

[Key words] Hypoxia precondition； Human placenta chorionic mesenchymal stem cells； Circular RNA； Expression profile

环状RNA是一类特殊的内源性RNA分子，大量存在于真核生物细胞中，是RNA领域最新的研究热点之一[1-3]。已有研究表明，circRNA参与了多种疾病、衰老等生理病理现象的发生发展过程[4]。目前，circRNA参与调控间充质干细胞生理过程的研究报道较少，而低氧预处理对间充质干细胞中circRNA表达的影响未见报道。因此，本研究预期筛选出低氧预处理人胎盘绒毛膜间充质干细胞差异表达的circRNA，为circRNA参与间充质干细胞的生物学功能提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

TRIzol试剂（Invitrogen life technologies），无RNA酶的水（Invitrogen life technologies），RNase R（Epicentre），人circRNA芯片v2.0（Arraystar），Arraystar Supper RNA Labeling试剂盒（Arraystar），二氧化氮培养箱（Labotect），基因芯片扫描仪（Agilent），计算机图像分析系统（Leica），基因芯片杂交仪（Illumina）

1.2 标本收集和分组

人胎盘绒毛膜间充质干细胞按照已有实验室方法提取并验證为合格的间充质干细胞[5]。本研究中，复温3例不同孕妇胎盘来源的P3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞，接种培养至80%融合时消化传代，1∶2分离培养，一瓶置于1%体积分数CO2培养箱中培养，为本次研究的实验组；一瓶置于21%体积分数CO2培养箱中培养，为本次研究的对照组。

1.3 环状RNA芯片实验操作流程

实验组和对照组细胞培养至70%～80%融合度时，用TRIzol提取总RNA，经RNase R处理，去除线性RNA，富集circRNA，然后用随机引物对circRNA进行扩增并转录为荧光cRNA。cRNA纯化后在circRNA芯片上65℃杂交17 h。杂交后的芯片洗片后，应用Agilent Scanner G2505C扫描。

1.4 数据采集与分析

将芯片扫描图片导入Agilent Feature Extraction软件提取原始数据，应用R软件包进行标准化和分析，两组样本间差异表达的circRNA通过变化倍数进行筛选。应用预测软件TargetScan和miRanda，对于每个差异倍数大于1.5倍的circRNA预测5个高匹配值的miRNA。

1.5 统计学方法

采用Rv.3.3统计学软件进行数据分析，以标准化处理后数据为基础，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义；筛选出倍数变化大于1.5，P < 0.05的circRNA为差异表达circRNA。

2 结果

2.1 散点图分析circRNA表达谱变化

用实验组和对照组表达的circRNA绘制散点图，平行于对角线的1.5倍线有效区分两组样本中表达一致和差异表达的circRNA。见图1（封四）。

2.2 火山图分析circRNA表达谱变化

用实验组和对照组表达的环状RNA绘制火山图，红色区域代表的circRNA符合差异表达条件的环状RNA（倍数变化>1.5倍，且P < 0.05）。见图2（封四）。

2.3 分层聚类分析circRNA表达谱的差异

用实验组和对照组表达的circRNA进行分层聚类分析，红色表示circRNA表达上调，蓝色表示circRNA表达下调。结果显示分层聚类分析能够正确区分实验组和对照组中circRNA的差异表达。见图3（封四）。

2.4 实验组和对照组差异表达circRNA筛选

实验组和对照组差异表达的circRNA共102条，其中实验组中表达上调的85条，下调17条（倍数变化>1.5倍，P < 0.05），每条circRNA均预测5个高配值的miRNA。见表1。

3 讨论

circRNAs（Circular RNAs，circRNA分子）是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴、并以共价键形成环形结构的内源性RNA分子。自从20世纪70年代Sanger等[6]首次在植物类病毒中发现circRNA以来，虽然经过几十年的发展，circRNA研究一直进展缓慢。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，人们在大规模研究转录组数据时，发现了大量的circRNA[7-9]。当Hansen等[10]报道circRNA作为分子“海绵”吸附miRNA从而影响基因功能，引起科研人员对circRNA的极大关注，circRNA不再被认为是基因转录后错误剪接的产物，使得circRNA成为目前生物医学领域研究热点之一[1-3]。已有研究表明，circRNA过高或过低表达，都与机体稳态失衡以及疾病有关，circRNA参与疾病发生发展、衰老等生理病理过程的研究成果不断报道[11-13]，但circRNA参与间充质干细胞相关生理过程的研究报道较少[14-15]，低氧预处理对间充质干细胞circRNA表達的影响未见报道。

已有研究表明，低氧对MSCs的细胞周期、凋亡、迁移、增殖和分化均有影响[16-17]。在氧体积分数<5%时，低氧预处理可以作为在一定程度上克服MSCs的增殖缓慢、移植后迁移率低、基因不稳定等细胞治疗缺陷的有效手段，可以提高其临床应用的有效性及安全性，对再生医学的研究有至关重要的意义[18]。

本研究中，对13 617条circRNA进行检测，获得有检测分析结果的circRNA为12 114条，通过同常氧条件下培养的hpcMSCs相比较分析，低氧条件下培养的hpcMSCs在circRNA表达谱上存在差异表达，按照差异表达倍数>1.5倍且P < 0.05的标准进行筛选，共获得102条差异表达circRNA，其中表达上调的85条，下调17条，表达差异达到2倍以上的27条，均为表达上调。提示这些差异表达的circRNA可能参与低氧条件下hpcMSCs的各种生物过程和分子调控机制。通过生物信息学技术分析差异表达circRNA的靶结合位点，软件预测显示多个circRNA和miR-150结合。文献检索分析表明，miR-150是一个重要的分子元件，涉及到影响间充质干细胞归巢的SDF-1/CXCR4轴通路[19-20]。因此，在目前的基础上，需要用qRT-PCR验证获得的circRNA，然后借助生物信息学技术、文献检索分析和LOF/GOF操作，上调或下调相关circRNA表达，观察细胞的生物学特征和功能，以及进一步用实验研究来验证circRNA引起hpcMSCs产生的具体生物过程。这些有待开展的研究将阐明低氧培养条件下hpcMSCs发生变化的一系列生理生物过程的发生机制，为间充质干细胞的临床细胞治疗提供科学依据。

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