沙利度胺对人宫颈癌裸鼠肿瘤及新生血管形成的影响

杨丽萍　侯俊德　马建彩

[摘 要] 目的：探讨沙利度胺对人宫颈癌HeLa细胞裸鼠皮下种植瘤的生长及肿瘤组织内新生血管形成的影响。方法： 建立宫颈癌裸鼠荷瘤模型，分为4组，每组10只。1）沙利度胺低剂量组：100mg·kg-1·d-1，0.2ml腹腔注射；2）沙利度胺中剂量组：200mg·kg-1·d-1，0.2ml腹腔注射；3）沙利度胺高剂量组：400mg·kg-1·d-1，0.2ml腹腔注射；4）对照组：0.5%羧甲基纤维钠0.2ml腹腔注射。给药2周后，观察各组裸鼠体重、计算肿瘤抑制率，采用免疫组化法检测移植瘤组织中血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）以及微血管密度（Microvessel Density，MVD）的变化。结果：用药2周后，各组裸鼠体内肿瘤抑制率呈现剂量依赖性，各组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组中VEGF及MVD的表达均低于对照组，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：沙利度胺对宫颈癌Hela皮下移植瘤的生长具有抑制作用，其作用可能与抗新生血管形成有关。

[关键词] 沙利度胺；人宫颈癌细胞；微血管密度；血管内皮生长因子

中图分类号：R737.33 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2016）05-015-03

DOI：10.11876/mimt201605006

宫颈癌是严重危害妇女健康和生命的最常见恶性肿瘤之一，其发病率及病死率在我国呈上升趋势，且日趋年轻化[1]。传统手术与放化疗是治疗宫颈癌的主要手段，但治疗效果有限，因此寻找新的、有效治疗手段至关重要。近年来，靶向治疗在临床实践中日益取得显著效果。它以肿瘤细胞分子的特征性改变为作用靶点，在发挥抗肿瘤作用同时、减少对正常细胞损伤。最近研究显示，沙利度胺具有广泛免疫调节作用和抗血管形成作用[2-3]，这一曾使上万名婴儿肢体畸形的药物再次引起人们重视。本研究旨在观察沙利度胺对Balb/c裸鼠宫颈癌Hela细胞皮下种植瘤抑制作用，为其在应用于宫颈癌治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

沙利度胺购自江苏常州制药厂，生产批号：20030302，以0.5%羧甲基纤维钠（CMC-Na）配成适当浓度，用于动物实验。小鼠抗人VEGF、CDl05单克隆抗体和即用型SABC法免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术工程公司。

1.2 动物及细胞株

Balb/c裸鼠，体重20g左右，无特殊病原菌（SPF）条件下饲养。人宫颈癌细胞株Hela，复苏后接种于Balb/c裸鼠传代。

1.3 裸鼠荷瘤模型的建立及实验分组

无菌条件下，在每只裸鼠左侧腋部皮下注射0.2 mL人宫颈癌Hala细胞悬液（1×107个/mL）。当移植瘤直径达到8mm开始给药。随机将荷瘤鼠分为4 组，每组10只。正常对照组：每只腹腔注射0.5%羧甲基纤维钠0. 2mL。其余3组腹腔内注射不同剂量沙利度胺：低剂量组：100mg·kg-1·d-1，0.2mL；中剂量组：200mg·kg-1·d-1，0.2mL ；高剂量组：400mg·kg-1·d-1，0.2mL；4组均给药2周，每周2次，共注射4次。

1.4 抑瘤率测定

给药2周后颈椎脱臼处死动物，称取肿瘤重量（m），计算抑瘤率。抑瘤率=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重× 100%。取出皮下种植瘤，用10%甲醛固定后制作石蜡切片。

1.5 移植瘤组织中VEGF和MVD的免疫组化检测

移植瘤标本经固定、包埋、切片后，按免疫组化SABC法进行染色，检测移植瘤组织中VEGF和CD105的表达。操作步骤严格按试剂说明书，PBS代替一抗作阴性对照。结果判断标准：①VEGF以胞膜或胞质出现棕黄色均匀颗粒的为阳性细胞。在400倍视野下随机选取 10个视野，分别计数每个视野内的阳性细胞数，计算阳性细胞的百分比：<10%为阴性（一）；10%～33%为弱阳性（+）；34%～66%为阳性（++）；>66%为强阳性（卅）。②MVD计数方法：40倍视野下选取5个微血管密集区，200倍视野下计数CDl05标记的毛细血管和微小血管，取其平均值代表MVD。

1.6 统计学方法

利用软件SPSS 14行单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 4组裸鼠荷瘤抑瘤率比较

给药2周后，各组裸鼠体内肿瘤的重量呈现剂量依赖性降低；并计算其抑制率，结果显示，沙利度胺低剂量组、沙利度胺中剂量组、沙利度胺高剂量组抑瘤率分别为24.13%、43.52%、52.67%，与对照组相比裸鼠荷瘤明显缩小。且沙利度胺高剂量组抑瘤作用最显著为52.67%，各组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 4组裸鼠荷瘤组织中VEGF及MVD的表达

与对照组相比，实验组中各组织中VEGF的表达（图1）和MVD（图2）的表达，随沙利度胺剂量的增加，依次递减，3个实验组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

沙利度胺（反应停，酞咪哌叮酮，thalidomide），曾因严重的致畸作用而被禁用[4]。但对其研究并未停止。近年来研究表明沙利度胺具有抗肿瘤作用，并可通过直接抑制VEGF表达、调节细胞迁移和黏附，抑制血管形成[5-7]，给抗血管生成治疗肿瘤带来了希望。有研究表明VEGF在宫颈癌组织中高表达，且与肿瘤分期、转移、预后有关[8]。本研究结果显示沙利度胺能抑制人宫颈癌Hela细胞的生长，并呈现剂量依赖性，随着沙利度胺浓度的增加，VEGF的表达呈不同程度的下降，呈浓度依赖性模式。表明沙利度胺可通过抑制肿瘤组织中VEGF的表达，从而抑制肿瘤细胞生长。

微血管密度是判断肿瘤预后的独立危险因素，并可作为直接衡量血管生成的标准[9-10]，与肿瘤的恶性程度密切相关[11]。研究显示CD105标记的MVD与宫颈癌、直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤的生长、转移及预后密切相关[12-13]。故本实验用CD105单克隆抗体对沙利度胺作用的裸鼠移植瘤的血管进行标记，结果显示瘤体内微血管密度变化与肿瘤生长活跃的浸润性生长过程新生血管化是同步进行的。提示沙利度胺能够通过减少裸鼠移植瘤组织内新生血管的密度，在一定程度上控制移植瘤的生长。

综上所述，沙利度胺可抑制Hela细胞移植瘤的生长，并可减少移植瘤组织中VEGF和 MVD的表达，且两者变化一致并呈现剂量依赖性。证明沙利度胺的抗肿瘤机制与抗新生血管形成有关。

参 考 文 献

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