蓝靛果花色苷对高脂血症大鼠肝脏内与胆固醇代谢相关基因的作用

于 伟，张桂芳，甄井龙，宋雪建，迟晓星，王振宇*

蓝靛果（Lonicera caerulea）属忍冬科忍冬属，是一种多年生灌木，多生长于东北、华北、西北等地区，不同地区别名也不同（如黑瞎子果（黑龙江）、狗奶子或羊奶子（黑龙江大兴安岭）、山茄子（黑龙江省七台河市勃利县）等），是一种适应性较好的灌木[1-3]。蓝靛果富含矿物质、氨基酸、多酚及VC等多种对机体有利的活性物质；具有抗氧化、抗病毒、抗疲劳、抗炎、抗辐射及改善肝功能等效果，具有极高的药用价值[1-5]。其果皮富含大量红色素，可以替代人工合成色素，更加安全健康；其果实多浆汁，种子极小，出汁率高，是制作饮料的极好原料[6-7]。蓝靛果在其他方面也有用途，如使用酵母发酵可使果酒的酸度下降13.2%，因此可以应用于高酸果酒的发酵[8]。其在模拟体外消化后，总酚含量提高48.2%，花色苷含量下降67.6%，单体花色苷种类减少，氧自由基吸收能力和总抗氧化能力分别降低80.0%和55.6%[9]。花色苷的酚羟基结构对活性氧等自由基有很强的捕捉能力[10-13]。花色苷类化合物通过清除自由基，能对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用，维持细胞膜的流动性和蛋白质的构型构象，具有明显抑制高血脂、预防心血管病的效果[14-16]。从葡萄中提取的花色苷可以有效地降低胆固醇和低密度脂蛋白水平，预防血栓形成，有助于预防心脑血管疾病的发生[17]。研究发现花色苷可使人体总胆固醇含量降低13%～26%，使低密度脂蛋白胆固醇含量降低21%～33%[18]，还可降低肝脏中甘油三酯含量[19]。综上，蓝靛果具有相当广阔的经济效益，值得开发利用。

本课题组在前期实验中发现蓝靛果花色苷可使肝脏丙二醛含量显著降低，有效减少肝脏过氧化损伤，预防动脉硬化的发生[2]。目前，在蓝靛果花色苷降低高脂血方面的研究虽然较多，但主要集中在血清脂肪酶、肝脂酶、脂代谢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶与肝X受体（liver X receptor α，LXRα）、胆固醇调节元件结合蛋白2及三磷酸腺苷结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）G5等方面。刘素稳[20]证明，蓝靛果花色苷能激活过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）-LXRa-ABCA1/胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7a1）信号通路，促进胆固醇流出，加速胆固醇胆汁酸代谢，降低肝脏中的胆固醇含量，减少大鼠体内的脂质积累，而B族I型清道夫受体（scavenger receptor class B, type I，SR-BI）是介导胆固醇逆转运的关键受体。为研究蓝靛果花色苷降低血脂水平及预防动脉硬化的主要途径及其作用机理，本实验利用超声辅助提取等方法从蓝靛果中提取蓝靛果花色苷，通过体内实验，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reactionm，qPCR）测定蓝靛果花色苷对高脂血症大鼠肝脏组织中LXRα、SB-BI、ABCG5、PPARγ及CYP7a1基因表达的影响，从基因表达水平上阐明蓝靛果花色苷对胆固醇代谢相关基因的影响，并阐明蓝靛果花色苷对与PPARγ-LXRa-ABCAl/CYP7al信号通路相关基因的作用。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

蓝靛果花色苷由黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心实验室自制。

2 月龄清洁级雄性Wistar大鼠60 只（许可证编号：SYXK（黑）2011-007） 哈尔滨医科大学实验动物学部；组织RNA提取试剂盒 美国OMEGA公司；焦碳酸二乙酯 上海信帆生物科技有限公司；SYBR Green qPCR试剂盒、逆转录试剂盒、培养基、血清、双抗、胰酶 美国Thermo Scientific公司；异丙醇、无水乙醇、氯仿 国药集团药业股份有限公司；小鼠巨噬细胞RAW264.7 上海北诺生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7300型qPCR仪 美国ABI公司；TG-16M低温冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；P2、P10、P20、P100、P200、P1000型移液枪 吉尔森P型移液器公司；K30漩涡振荡器 上海青浦沪西仪器厂；PRO200电动匀浆机 德国弗鲁克公司。

1.3 方法

1.3.1 动物模型及分组

选择2 月龄，清洁级雄性Wistar大鼠60 只，按体质量随机分成6 组，每组10 只。其中10 只为基础饲料对照组，给予普通饲料；其余50 只给予高脂饲料（78.8%（质量分数，下同）普通饲料、10.0%猪油、10.0%蛋黄粉、0.2%胆酸钠、1.0%胆固醇）[21-22]，同时每笼每天添加辅食油渣50 g（约占每只雄鼠饲料摄入量的8%～10%），自由饮食饮水，每10 d称一次体质量。30 d后断尾取血，测血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）浓度。30 d造模后，实验性高脂血症大鼠平均TG浓度（（3.48±1.37）mmol/L）极显著高于基础饲料对照组（（1.94±0.53）mmol/L）（P＜0.01）；实验性高脂血症大鼠平均TC浓度（（2.42±0.28）mmol/L）显著高于基础饲料对照组（（1.70±0.48）mmol/L）（P＜0.05），表明高脂饲料喂养的50 只大鼠均造模成功。将高脂血症大鼠随机分为5 组，分别为高脂血症模型对照组（HFD，灌胃1.2 g/（kg·d）生理盐水）、阳性对照组（PC，灌胃10 mg/（kg·d）辛伐他汀片）和蓝靛果花色苷低（HFD+L）、中（HFD+M）、高（HFD+H）剂量组（分别灌胃4.0、40.0、120.0 mg/（kg·d）蓝靛果花色苷），并设置基础饲料正常对照组（ND，1.2 g/（kg·d）生理盐水灌胃）[2]。大鼠灌胃5 周后，乙醚麻醉，解剖摘出脏器（心、肝、脾、肾），用手术剪去除结缔组织后称质量，以脏器质量与体质量的百分比为脏器指数。

1.3.2 qPCR检测肝脏SR-BI、LXRα、ABCG5、PPARγ及CYP7a1基因表达水平

称取30 mg肝脏组织，常规Trizol试剂提取总RNA进行反转录，程序为：37 ℃、60 min；85 ℃、5 min；4 ℃、5 min；产物置于－20 ℃保存。将制备好的cDNA进行qPCR扩增，程序为：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s；60 ℃、45 s，40 个循环；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min；95 ℃、15 s；60 ℃、15 s。

使用NCBI引物设计工具设计qPCR扩增引物，由上海生工生物技术有限公司合成，具体见表1。

表1 qPCR引物Table 1 Primers of qPCR

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，实验数据均以 ±s表示，T检验进行显著性分析，以P＜0.05表示差异显著，以P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 蓝靛果花色苷对高脂血症大鼠脏器质量的影响

表2 大鼠脏器指数Table 2 The ratio of viscera and body weights of rats%

由表2可以看出，在给予蓝靛果花色苷干预后，与ND组相比：蓝靛果花色苷各干预组心脏指数极显著升高（P＜0.01）；HFD+H组肝脏指数显著升高（P＜0.05）；各组大鼠脾脏指数无明显变化（P＞0.05）；HFD+H组肾脏指数显著升高（P＜0.05）。与HFD组相比：蓝靛果花色苷干预各组大鼠脾脏指数无显著差异（P＞0.05）；HFD+M组肝脏指数极显著降低（P＜0.01），肾脏指数、心脏指数显著降低（P＜0.05）。综上，与HFD组比，除HFD+M组对高脂血症大鼠的肝脏指数、心脏指数和肾脏指数有影响外，蓝靛果花色苷各干预组对其他脏器指数几乎没有明显影响。

2.2 蓝靛果花色苷对于高脂血症大鼠肝脏SR-BI、LXRα、ABCG5、PPARγ及CYP7a1 mRNA表达的影响

图1 蓝靛果花色苷对大鼠肝脏组织中SR-BI mRNA表达水平的影响Fig. 1 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of SR-BI in liver tissues of rats

如图1所示，经蓝靛果花色苷干预后，高脂血症大鼠肝脏中SR-BI mRNA表达水平几乎不受影响（P＞0.05）。

图2 蓝靛果花色苷对大鼠肝脏组织中LXRα mRNA表达水平的影响Fig. 2 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of LXRα in liver tissues of rats

如图2所示，经蓝靛果花色苷干预后，LXRα mRNA表达水平有所提高，HFD+M组（3.35±1.27）、HFD+H组（3.26±1.34）与ND及HFD组LXRα mRNA表达水平均存在极显著差异（P＜0.01）；HFD+L组（1.62±0.52）仅与HFD组存在显著差异（P＜0.05）。综上，中、高剂量蓝靛果花色苷对LXRα mRNA表达水平有明显提高作用。

如图3所示，蓝靛果花色苷干预对高脂血症大鼠ABCG5 mRNA表达水平无显著影响（P＞0.05）。

如图4所示，蓝靛果花色苷干预后，高脂血症大鼠PPARγ mRNA表达水平明显降低，HFD+L（0.60±0.20）、HFD+M（0.45±0.32）、HFD+H（0.55±0.52）组与HFD组相比差异极显著（P＜0.01）。表明蓝靛果花色苷各干预组可以极显著降低高脂血症大鼠PPARγ mRNA表达水平（P＜0.01）。综上，蓝靛果花色苷对高脂血症大鼠体内与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、2型糖尿病及动脉硬化症等相关的基因PPARγ的mRNA表达有抑制效果。

图3 蓝靛果花色苷对大鼠肝脏组织中ABCG5 mRNA表达水平的影响Fig. 3 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of ABCG5 in liver tissues of rats

图4 蓝靛果花色苷对大鼠肝脏组织中PPARγ mRNA表达水平的影响Fig. 4 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of PPARγ in liver tissues of rats

图5 蓝靛果花色苷对大鼠肝脏组织中CYP7a1 mRNA表达水平的影响Fig. 5 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of CYP7a1 liver tissues of rats

如图5所示，在经过蓝靛果花色苷干预后，高脂血症大鼠肝脏中CYP7a1 mRNA表达水平显著增高，与ND组、HFD组相比，HFD+M和HFD+H组均具有极显著差异（P＜0.01），而HFD+L组差异不显著（P＞0.05）。表明中、高剂量蓝靛果花色苷可以极显著提升高血脂症大鼠肝脏中CYP7a1 mRNA表达水平，并且中剂量蓝靛果花色苷的提升作用最为明显。

3 讨 论

体内核受体（nuclear receptor superfamily，NRs）可以调节内分泌系统，通过内源性和外源性配体物质激活调控靶基因的转录，从而达到对繁殖、发育、代谢和免疫应答的稳态控制[23]。LXRs属于NRs超家族成员，有LXRα和LXRβ两种同源亚型，其中LXRα分布广泛，在肝脏、脂肪和巨噬细胞中表达较多，在大脑内也有表达[24-25]。LXRs可以通过调控ABCG1来调控膜胆固醇在体内的水平[24]，而LXRs的激活可以提高ABCG5及ABCG8的表达，将胆固醇转移至回肠腔[25]。Hu Yanwei等[26]发现，LXRα siRNA可以阻止二氢辣椒碱（dihydrocapsaicin，DHC）诱导的ABCA1、ABCG1、ABCG5、SR-B1、LDLR、载脂蛋白A和载脂蛋白E表达提高，但对DHC诱导的PPARγ表达无影响；而PPARγ siRNA使DHC诱导的LXRα表达上调明显下降，对PPARγ/LXRα通路的抑制会降低动脉粥样硬化的发病率。刘伟治等[27]的研究表明，人LXRα受到LXRα、PPARγ基因的调节，人巨噬细胞中的LXRα会发生自我催化现象，但是鼠中未发现此类现象。

CYP7a1是胆固醇合成胆汁的限速酶，CYP7a1也是LXRs的靶基因之一，LXRα可以调节CYP7a1的表达，影响胆固醇向胆汁酸的转变[28-29]，CYP7a1的表达升高可以降低血浆胆固醇的含量[30-31]。脂肪分解相关基因CYP7a1能够将肝脏中的TC以胆汁酸的形式排出体外，从而降低肝脏中TC含量，提高ABCA1的表达[25,32]。LXRα通过调节尼曼匹克C1样蛋白（niemann-pick C1 like 1，NPC1L1）和ABCG5及ABCG8异二聚体的表达，调节肠胆固醇吸收[25,32]，肝脏ABCG5及ABCG8水平过高会导致胆汁胆固醇水平升高，甚至达到过饱和[33-36]。申婷婷等[37]的研究发现，通过对小肠胆固醇吸收、转化等基因表达的抑制，上调肠道中促进胆固醇向外排泄基因ABCG5/8表达水平，可以调节胆固醇代谢。小肠中ABCG5/8可以调控胆固醇的吸收，促进胆固醇排向回肠[38-40]。虽然ABCG5和ABCG8可以抑制小肠胆固醇的吸收从而降低血清胆固醇水平，但本实验中蓝靛果花色苷并未对ABCG5基因表达产生影响。

PPARs是一种新型甾体类激素受体，也是配体激活转录因子，有PPARα、PPARβ、PPARγ 3 种亚型，PPARs可不同程度地被脂肪酸与其衍生物激活，参加脂质代谢调节，其中PPARα和PPARγ在脂肪肝和IR的发生、发展中存在重要影响[41]。PPARγ mRNA的表达水平与IR呈正相关，而IR是2型糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）及动脉硬化症等疾病发生的病理基础[42-43]。本实验结果显示，蓝靛果花色苷可以降低PPARγ mRNA的表达，而刘素稳[20]的研究显示，花色苷提取物可以提高肝脏内PPARγ mRNA的表达。Yamauchi等[44]发现，可通过适度地抑制非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）/NASH及IR中PPARγ的活性，抑制前脂肪细胞的分化，减少白色脂肪组织、骨骼肌及肝脏中TG的含量，并增强脂肪酸的氧化程度，改善IR，使肝内脂肪变性程度减轻。

SR-BI是介导胆固醇逆转运的关键受体，能够引起胆固醇的双向转运。一方面，SR-BI可以介导外周细胞内过剩的游离胆固醇流出，防止游离胆固醇过多堆积造成动脉粥样硬化；另一方面，SR-BI可以与高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）结合，促进肝细胞摄取HDL中的胆固醇，使过剩的胆固醇回到肝脏进行进一步代谢。提高SR-BI基因的表达可以促进胆固醇外流，降低血浆胆固醇水平[45]。综合来看，PPARγ、LXRα、CYP7a1等基因在胆固醇转化过程中均起到非常重要的作用。

高脂血症能够导致脂肪肝、肝硬化、胆石症、胰腺炎及动脉粥样硬化等疾病的发生，而蓝靛果花色苷可以降低TC、TG、低密度脂蛋白胆固醇在血清中的含量，升高高密度脂蛋白胆固醇含量，有效降低肝脏过氧化损伤，预防动脉粥样硬化的发生[2]。本实验结果显示，蓝靛果花色苷对SR-BI及ABCG5 mRNA表达无影响，其通过降低PPARγ mRNA表达水平、提高LXRα及CYP7a1 mRNA表达水平来调节高脂血症大鼠的血脂水平，预防动脉粥样硬化的发生。