菟丝子提取物对失眠大鼠学习记忆能力及神经递质的影响*

★ 刘海云 宋渺渺 肖爱娇*（江西中医药大学基础医学院 南昌 330004）

失眠是一类以经常不能正常睡眠为特征的疾病，临床常见病症是入睡困难、睡眠质量下降和睡眠时间减少，记忆力、注意力下降等［1］。随着生活节奏的加快和工作压力的增加，失眠人群呈逐年增多的趋势。根据最新睡眠调查研究结果显示中国成年人失眠率为39.3%［2］。失眠降低了患者的生活质量，严重影响了自身及家人的身心健康。对于失眠临床上常用的药物副作用比较大，有成瘾性和依赖性。因此寻找一种有效而副作用小的药物预防和治疗失眠是当务之急。中药菟丝子是一年生攀缘性的草本寄生性种子植物，是一种常用补阳药物，性平、味辛甘，归肾、肝、脾经，具有补肾益精、养肝明目、固精缩尿、安胎止泻的功效［3］。本实验室对菟丝子的研究较多，本团队关于菟丝子方面的国家级省厅级课题有10余项，论文几十篇都主要局限于性腺生殖内分泌方面的研究，但在失眠方面的研究还未涉及。此次实验利用PCPA致大鼠失眠作为实验模型，通过观察中药菟丝子对失眠大鼠学习记忆能力的影响并测定中药菟丝子对大鼠神经递质5-羟色胺（5-HT）及多巴胺（DA）含量的影响并初步探讨其治疗失眠的作用及其机制。

1 材料

1.1 动物SPF级SD大鼠50只，体重（200±20）g，大鼠由江西中医药大学实验动物中心提供，雌雄各半，许可证号SYXK（赣）2016-0026。室温20℃～22℃，空气新鲜，通风良好，大鼠雌雄分笼固体饲料喂养，自由饮水，正式开始实验前适当饲养7天左右。

1.2 试剂五羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、对氯苯丙氨酸（PCPA）试剂盒均购于Sigma有限公司。安定（地西泮）注射液购于江西中医药大学附属医院门诊部，中药菟丝子购于南昌益丰大药房。

1.3 仪器微量进样器（德国eppendorf公司）；恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；AdventurerTM电子天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；TGL-16G型台式高速离心机（上海市实验仪器总厂）；TECAN酶标仪sunrise（奥地利TECAN公司）。

2 方法

2.1 菟丝子提取物的制备［4］称取菟丝子中药250g，加入2000mL水浸泡120min，至菟丝子药材微胀，微火煎煮2次，每次煎煮时间30min，过滤2次提取液合并一起，至水浴锅中浓缩至生药浓度为0.4g/mL，放于美的冰箱冷藏，备用。

2.2 动物分组与给药SPF级SD大鼠50只，雌雄各半，随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组（安定组注射液0.92mg/kg）、菟丝子给药组（菟丝子100、300mg/（kg·d）剂量组），各组10只。除空白对照组外，其他各组均采用腹腔注射PCPA混悬液（350mg/kg）建立大鼠失眠模型，每天1次，连续2天［5］。从造模第3天开始阳性对照组给于灌胃安定注射液（0.92mg/kg）（安定注射液的给药量是根据成人的临床用量，按大鼠的等效剂量折算系数得来的），菟丝子给药组同时给予灌胃不同浓度的菟丝子低、高剂量提取物，正常对照组和失眠模型组给于相同体积的生理盐水灌胃，每天灌胃给药1次，持续7天。，

2.3 学习记忆能力测试Y迷宫行为学的观察 参 照 文 献［6］。 在 MG-2型 Y 迷 宫（ 规 格100mm×150mm×250mm）内，分安全区（A）、电击区（B）和起步区（C）。在实验测试时接通电流给予小鼠电刺激，小鼠从C区接受电击刺激后，能1次性从C区直接跳到A区为正确反应，否则属错误反应。通过观察它能否有效避开并正确找到安全区来判断小鼠的学习和记忆能力。实验小鼠最后一次给药60min后，开始进行学习记忆能力训练，首先把小鼠放入Y迷宫并让其适应6～8min，再进一步把实验小鼠放进起步区，接通电流，记录小鼠接受电击后的反应，并记录其结果。注意两次电击训练之间让小鼠休息1min。如果连续训练10次都对或者9次正确即为小鼠已经学会空间辨认。达标时所需的训练次数作为学习成绩。一天后用相同的训练方法再进行训练，训练时的错误次数记为记忆成绩。

2.4 血清的制备最后一次给药12h后腹主动脉取血，放于离心机（3000r/min）离心10min，微量加样器吸取上清液备用。-70℃保存备用。

2.5 血清中5-HT和DA的测定按试剂盒里的详细说明步骤进行操作，测定5-HT和DA的含量。

2.6 统计处理各组实验数据用统计分析软件SPSS 17.0进行处理，实验结果以 表示，通过LSD法分析并进行组间两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况造模前饲养期间，大鼠活动正常，警惕性高，进水进食正常，昼夜活动规律，毛发有光泽，给于腹腔注射PCPA后，大鼠出现明显的失眠症状，昼夜节律紊乱，白天活动增强，兴奋性和攻击性都明显增加，饮食减少，体重减轻，毛发变得无光泽，表明造模成功。给于安定和菟丝子治疗后，失眠的症状有所改善，昼夜规律逐渐恢复正常但给药组稍低于安定组，但比模型组好转很多。

3.2 菟丝子对失眠大鼠学习记忆能力的影响失眠模型组与正常对照组相比，学习达标次数和记忆错误次数均增多，表明学习记忆能力下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；菟丝子给药组与失眠模型组相比，大鼠学习和记忆错误次数减少，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表 1。

表1 菟丝子提取物对失眠大鼠学习记忆能力的影响（ ，n=10） 次

3.3 菟丝子对失眠大鼠血清5-HT和DA含量的影响与正常对照组比较，失眠模型组大鼠血清5-HT含量显著降低，DA含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。与模型组比较，菟丝子低、高剂量给药组和安定组大鼠血清5-HT含量均显著升高，DA含量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。见表 2。

表2 菟丝子提取物对失眠大鼠血清5-HT和DA含量的影响（ ，n=10） ng/mL

4 讨论

对氯苯丙氨酸（PCPA）是5-HT合成的抑制剂，通过抑制色氨酸轻化酶降低5-HT的含量但同时又不会损伤神经元，此种造模方法经济有效，造模时间短，成功率很高，是目前国内外常用的大鼠失眠模型的造模方法［5，7-9］。大鼠腹腔注射PCPA后，可选择性地阻断脑5-HT的合成，使脑5-HT含量下降，睡眠减少，甚至消失。关于睡眠的机制目前不是很明确，一些研究表明，睡眠是一种中枢神经系统调节的过程，其发生与中枢的一些结构和神经递质如5-HT、DA、NE等有关［10］。5-HT和DA是调节睡眠和觉醒的主要物质，5-羟色胺的神经元主要分布于中缝核群，在觉醒时5-HT神经元分泌大量的5-HT作用于中枢的特定部位，促进促眠因子的释放启动睡眠［11］。大鼠通过腹腔注射对氯苯丙氨酸（PCPA），阻断了体内5-HT的合成，降低了血清5-HT的含量，从而造成睡眠启动障碍，睡眠减少甚至消失。本实验研究结果表明，与正常对照组相比，失眠模型组大鼠血清中5-HT含量显著降低；与失眠模型组相比，菟丝子低、高剂量组大鼠血清中5-HT含量明显升高。说明菟丝子取物对失眠大鼠体内5-HT有明显的增强效果，从而进一步起到治疗失眠的作用。

DA是觉醒状态下的重要的单胺类神经递质，通过体内DA能神经系统发挥作用，如果体内DA神经元兴奋，体内DA含量升高就会造成睡眠减少，觉醒增加。本实验研究结果表明，与正常对照组相比，失眠模型组大鼠血清中DA含量显著增加；与失眠模型组相比，菟丝子低、高剂量组大鼠血清中DA含量明显降低。说明菟丝子提取物有降低失眠大鼠体内DA的含量，从而进一步起到治疗失眠的作用。

总之，实验研究结果表明失眠模型组大鼠学习记忆能力和5-HT含量下降，DA含量显著升高，而菟丝子提取物干预后能明显改善失眠大鼠的学习记忆能力，显著升高血清中5-HT含量，降低其DA含量，证明菟丝子提取物在治疗失眠方面有一定作用，为进一步研究菟丝子的临床应用奠定了基础。