咪喹莫特对BALB/c和C57BL/6小鼠银屑病样皮损诱导作用的比较

吴剑平，谢 倩，陈 林，张军峰，史丽云，詹 瑧

(南京中医药大学，南京 210023)

银屑病是以皮肤反复出现炎性增生为典型表现的自身免疫性疾病，目前其发病机制尚未完全阐明[1-2]。咪喹莫特作为Toll样受体激动剂，可通过与TLR-7/8结合，诱导皮肤出现表皮增厚、棘层肥厚、角化不全、嗜中性粒细胞聚集等银屑病样表现，目前常被用于银屑病动物模型的诱导剂[3]。BALB/c和C57BL/6小鼠是目前最常用于该类动物模型研究的两种小鼠品系，但这两种模型有无差异，哪种模型更适用于人类银屑病研究则鲜见报道。本研究即采用BALB/c和C57BL/6两种小鼠品系，比较不同时间点咪喹莫特诱导的两种模型小鼠皮肤形态学、病理组织学等方面的差异，并探讨IL-23/IL-17炎症轴在模型进展中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠各24只，均为雌性，体重20～22 g， 7～8周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司南京分公司提供[SCXK (苏) 2016-0003]。实验期间小鼠均饲养在屏障环境[SYXK (苏) 2014-0001]中，按照国标GB 14925-2010[4]的有关要求控制环境参数。实验前先给予3 d健康适应期，饲养和实验期间动物自由饮食。

1.2 主要试剂与仪器

明欣利迪乳膏(5%咪喹莫特)购自四川明欣药业有限责任公司；SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix购自Invitrogen公司；实时荧光定量PCR引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Power SYBR® Green PCR Master Mix购自Applied Biosystems公司。Olympus显微镜购自日本；CFX384多重实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组处理

咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型观察期多为4～6 d[3, 5-6]，故本研究选择6 d作为模型观察终点。BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠均随机分为4组，每组6只，分别为涂药0 d组(即正常对照组)、涂药2 d组、涂药4 d组和涂药6 d组。

各组处理如下：动物于涂药前一天背部剃毛，形成约2 cm × 3 cm大小的皮肤暴露区。涂药组小鼠每天涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg，并分别于涂药后2 d(涂药2 d组)、4 d(涂药4 d组)、6 d(涂药6 d组)采样。涂药0 d组小鼠背部剃毛后，不做任何处理，第2天直接采样。采样时小鼠先颈椎脱臼处死，剪下背部涂药部位皮肤，分成两块，一块放入10%甲醛中固定，另一块放入-80℃冻存。本实验研究的IACUC号为ACU170704，实验过程中严格按照实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.3.2 皮损严重程度(psoriasis area and severity index，PASI)评分

PAIS评分标准如下：0，无；1，轻度；2，中度；3，重度；4，极重度。采用相机每天拍照记录小鼠皮损情况，同时按PAIS标准对皮肤红斑(erythema)、鳞屑(scales)及浸润增厚程度(thickness)进行0～4的评分，将3种积分累计得到总积分。绘制各组小鼠积分变化趋势图，观察各组小鼠皮损的变化情况。

1.3.3 皮损病理组织学检测

HE染色观察小鼠皮肤有无变性、坏死、溃疡、痂皮形成，上皮层有无增厚、表面角化不全或角化过度、真皮或皮下组织内有无充血、水肿、炎细胞浸润等病变。之后在200倍光镜下，采用计算机图像分析系统(DP2-BSW)测量每只动物的表皮层厚度。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测

采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法测定各组小鼠皮肤组织IL-23/IL-17轴相关免疫因子IL-23、IL-17A和IL-17F mRNA的相对表达量。以β-actin为内参，实验结果采用2-△△Ct法进行相对定量。各引物序列如下：IL-23(上游)：5’-AACAACAGCTCGGATTTGGTAT-3’；IL-23(下游)：5’-ATGACCAGGACATTCAGCAGT-3’；IL-17A(上游)：5’-TCAGCGTGTCCAAACACTGAG-3’；IL-17A(下游)：5’-CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT-3’；IL-17F(上游)：5’-TGCTACTGTTGATGTTGGGAC-3’；IL-17F(下游)：5’-CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT-3’；β-actin(上游)：5’-CTGAGAGGGAAATCGTG CGTGAC-3’；β-actin(下游)：5’-GAACCGCTCG TTGCCAATAGTGAT-3’。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组背部皮肤形态学变化

如图1可见，正常对照组(0 d组)小鼠皮肤均光滑，无鳞屑、皱褶、红斑等。涂药2 d后，BALB/c小鼠背部即开始出现细小鳞屑和点状红斑。第3天开始出现少量皱褶。涂药4 d后，背部皮肤明显增厚，鳞屑变为小块状、红斑连成片状，皱褶呈条状隆起。涂药6 d后，鳞屑开始部分脱落，脱落部位可见点状出血。与BALB/c小鼠比较，C57BL/6小鼠于涂药3 d后才出现少量鳞屑及点状红斑，之后症状缓慢加重。同一时间段比较，C57BL/6小鼠鳞屑、皱褶、红斑、皮肤增厚等症状均较轻，至涂药第6天鳞屑未见脱落。见图1。

2.2 各组背部皮损PAIS评分变化

按PAIS评分标准绘制病变积分趋势线，随涂药天数增加，病变积分逐渐增高，与形态学观察结果一致，且同一时间段BALB/c小鼠的积分均高于C57BL/6小鼠，差异有显著性(P< 0.05或P< 0.01)。见图2。

2.3 背部皮损病理组织学变化

HE染色结果可见，正常组皮肤较薄，表面有少量角化，无充血、出血及炎症细胞浸润。涂药2 d后表皮开始出现增厚，皮肤表面出现痂皮及少量角化。真皮可见轻度充血及少量炎细胞浸润，以中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润为主。与同时间段C57BL/6小鼠比较，BALB/c小鼠皮肤增厚及角化不全较重。涂药4 d后，BALB/c小鼠鳞状上皮和表皮增厚、角化不全、炎症浸润等情况均较C57BL/6小鼠严重。涂药6 d后，BALB/c小鼠被覆厚层鳞状上皮，表皮进一步增厚，角化不全严重，真皮层有轻度充血、出血，炎症细胞浸润增多。与BALB/c小鼠比较，C57BL/6小鼠表皮增厚、角化不全等病变程度明显较轻。通过表皮厚度测量可见，2 d组、4 d组和6 d组BALB/c小鼠表皮厚度均大于同时间段C57BL/6小鼠，差异均有显著性(P< 0.05或P< 0.01)。见图3。

图1 不同品系小鼠背部皮肤形态学变化Figure 1 Morphological changes of mouse back skin in different strains

注：同一时间点，BALB/c小鼠与C57BL/6小鼠比较，*P< 0.05，**P< 0.01。图2 小鼠背部皮损PASI评分变化趋势图Note. BALB/c mice compared with C57BL/6 mice at the same time,* P< 0.05,**P< 0.01.Figure 2 The PASI scores of skin lesions in the mouse

注：A：涂药局部皮肤病理组织学变化(HE染色，× 100)；B：表皮厚度变化。同一时间点，BALB/c小鼠与C57BL/6小鼠比较，* P< 0.05，**P< 0.01。图3 各组小鼠皮损病理组织学的变化Note. A: Histopathological changes of the local skin after drug was applied. HE staining (× 100). B: Changes of epidermal thickness. BALB/c mice compared with C57BL/6 mice at the same time,* P< 0.05,**P< 0.01.Figure 3 The histological changes of mouse skin lesions

注：与BALB/c小鼠0 d组比较，* P< 0.05，**P< 0.01；与C57BL/6小鼠0 d组比较，# P< 0.05，## P< 0.01。图4 不同品系小鼠皮损组织IL-23、IL-17A、IL-17F mRNA的相对表达量Note. Compared with BALB/c mice of the 0 d group,* P< 0.05,**P< 0.01. Compared with C57BL/6 mice of the 0 d group,# P< 0.05,## P< 0.01.Figure 4 The relative expression of IL-23, IL-17A, and IL-17F mRNA in skin lesions of different strains of mice

2.4 IL-23/IL-17轴相关细胞因子mRNA的表达

BALB/c和C57BL/6小鼠在造模后，其IL-23、IL-17A、IL-17F的mRNA相对表达量均呈抛物线样变化。与0 d组比较，两种小鼠在造模2，4，6 d后，IL-23、IL-17A、IL-17F均有明显升高(P< 0.05或P< 0.01)。其中，BALB/c小鼠IL-23、IL-17A、IL-17F的mRNA表达水平在用药2 d后即达到峰值，之后逐渐降低。C57BL/6小鼠IL-23、IL-17A、IL-17F的mRNA表达水平在用药4 d后达到峰值，之后逐渐降低。见图4。

3 讨论

银屑病是目前最常见的自身免疫性疾病之一，发病率高达2%左右[7-8]。其病因及发病机制尚未完全阐明，且尚无有效的治愈方法[9]。银屑病的临床特点主要为反复发作的皮肤过度角化、鳞屑、红斑形成，并伴有炎细胞浸润、新生血管形成、IL-6、TNF-α等细胞因子的分泌。银屑病的动物模型有多种，如药物诱导型模型、阴道上皮模型、基因突变及转基因模型等[10-12]。咪喹莫特诱导的小鼠模型，因其制作方法简单、致病机制与人类银屑病类似等原因，近年来被广泛用于人类银屑病研究[3, 13-14]。据文献报道及本实验室以往的研究经验发现，该方法诱导的模型，一般于造模第6天银屑病样症状达高峰，之后症状逐渐减弱直至完全缓解，因此模型观察期一般以6 d为宜[3, 15-16]。

本研究显示，通过背部连续6 d涂抹62.5 mg的5%咪喹莫特乳膏(明欣利迪)后，可诱导BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠逐渐出现鳞屑、红斑、皮肤增厚及皱褶等典型银屑病样皮损，病理组织学鳞状上皮与表皮增厚、角化不全、角化过度、真皮充血、出血、炎症细胞浸润等改变均类似人类银屑病表现。但同时间段两种模型动物比较，BALB/c小鼠银屑病样症状出现更早、进展更迅速，且症状更严重，银屑病样皮损更典型。于涂药2～3 d后，BALB/c小鼠即开始出现细小鳞屑、红斑等症状，4 d后鳞屑、皮肤增厚、红斑等症状逐渐加重，到第6天达高峰。PAIS评分各项指标比较，BALB/c小鼠也均高于C57BL/6小鼠。HE染色发现，随着涂药天数的增加，两种动物模型表皮增厚、皮肤表面痂皮、角化不全、真皮充血、出血、炎症细胞浸润等表现均逐渐加重。但与形态学改变一致，BALB/c小鼠的各项病理指标变化均更显著且典型。

相关文献报道，咪喹莫特作为Toll样受体(TLR-7/8)激动剂，其诱导小鼠银屑病样皮损的机制与IL-23/IL-17轴的激活有关[3, 17]。本研究同时测定了IL-23/IL-17轴相关细胞因子的表达。结果发现，BALB/c小鼠的IL-23、IL-17A和IL-17F等细胞因子的表达在涂药2 d后即达高峰，之后逐渐回落，而C57BL/6小鼠在涂药4 d后各项细胞因子才达高峰，之后逐渐回落，该结果与van der Fits等人[3]的结果趋势一致，提示在咪喹莫特诱导的银屑病模型中，IL-23/IL-17轴的激活要先于银屑病样皮损的出现，也进一步揭示IL-23/IL-17轴的激活是皮损出现的诱导因素。同时BALB/c小鼠IL-23/IL-17轴的激活要先于C57BL/6小鼠，提示IL-23/IL-17轴的优先激活是BALB/c小鼠模型进展更加迅速的主要原因之一。

综上可见，咪喹莫特可诱导BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠皮肤均出现银屑病样皮损表现，其中BALB/c小鼠症状出现更早，进展更迅速，鳞屑、皮肤增厚、角化过度及不全、炎症细胞浸润等皮损改变更典型。鉴于该模型病程短，且具有自限性等特点，BALB/c小鼠可能更适合用于人类银屑病研究。此外，本研究表明IL-23/IL-17轴的激活可能是诱发小鼠银屑病样皮损的关键因素之一。