藏药久美2号对抗小鼠继发性多房棘球蚴病的疗效研究※

洛桑达哇 ，刘文磊，杨宝良，汤 锋，王海久，久美彭措，樊海宁*

(1.青海大学附属医院肝胆胰外科，青海 西宁 810001；2.青海省包虫病研究重点实验室，青海 西宁 810001；3.青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810001；4.青海省久美藏药药业有限公司 青海 西宁 810001)

多房棘球蚴病(alveolar echinocococosis，AE)又称泡型包虫病，治疗药物主要为苯并咪唑衍生物，如阿苯达唑(ABZ)和甲苯咪唑，但这些药物的主要作用是抗寄生虫生长，而不是杀灭寄生虫，同时有效率较低，长期应用后还会产生严重的副作用[1]。因此，探索新药物受到研究者的关注，也成为近年来的研究热点。经过多年研究发现，我国传统医学对棘球蚴病的发生、病理变化有着较深的认识，同时在实践中总结了一些较为可靠的治疗方法。国内学者通过动物实验研究证实了中药消包粉、汉防己甲素在小鼠的抗棘球蚴病的治疗中有一定的效果，且汉防己甲素与阿苯达唑联用时能增强阿苯达唑的疗效[2]。本实验中所使用的藏药久美2号属于广谱类驱虫药，其主要成分酸藤果、紫铆子、天仙子等几种药材组成，用于治疗钩虫、蛔虫、鞭虫、蛲虫、施毛虫等寄生虫病，本实验在体内、体外水平研究并观察藏药久美2号对小鼠多房棘球蚴病的对抗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

藏药久美2号(青海久美藏药药业有限公司)，RPMI-1640(Gibco公司)，青霉素-链霉素混合溶液(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)。振荡混匀器(Thermo公司)，超声破碎仪(冠森生物公司)，制冰机(上海析达仪器公司)，BT224S电子天平(北京赛多利斯科学仪器公司)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，恒温箱(中国常州国华公司)，纯水制备器(Thermo公司)，制冰机(上海析达仪器公司)，BB150型培养箱(Thermo公司)，Axio Vert.A1型光学显微镜(蔡司公司)，微量加样器(Eppdorf公司)，细胞培养瓶(美国康宁公司)。

SPF级BALB/c小鼠[7～8周龄，购于维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001]。

1.2 实验方法

1.2.1 藏药久美2号在体外对小鼠继发性多房棘球蚴原头蚴的作用观察

1.2.1.1 原头蚴提取

在已感染多房棘球蚴的小鼠(取自青海省包虫病研究重点实验室)腹腔内取出感染病灶组织，用含双抗的PBS溶液(60μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素)冲洗数次后，在含双抗的PBS溶液中将病灶剪碎，然后将含病灶碎片的溶液进行两次过滤(先后通过孔径为150、30μm的聚酯纱)，过滤后得到的沉淀即为原头蚴[3]，再用含双抗的PBS冲洗三次后，若镜检活原头蚴占90%左右即可进行体外培养。

1.2.1.2 药物处理

将久美2号水提物溶于RPMI1640培养液中，通过超声破碎法配制成溶液(160mg/mL)备用。实验分为两组，实验组和对照组(未加入药物的培养基)。其中实验组分为高浓度组(16.0mg/mL)、中浓度组(8.0mg/mL)、低浓度组(1.6mg/mL)。

1.2.1.3 原头蚴的体外培养及活性测定

在RPMI1640培养液中加入20%胎牛血清和双抗(60μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素)至终体积为40 mL，再将配好的培养基加入到已提取的原头蚴中，使浓度为(1000～2000)个原头蚴/mL，将所得原头蚴溶液与浓度为160 mg/mL的药物(高浓度组50μL，中浓度组25μL，低浓度组5μL)加入24孔板中，每孔0.5 mL，混匀后置于培养箱(37℃、5%CO2)中培养，每天各组吸出一个孔(即0.5mL)中的混合溶液，用0.4%台盼蓝染液染色，3 min内进行计数(镜下观察，死亡原头蚴被染成蓝色，未着色为活原头蚴)，每次计数原头蚴约300个。

1.2.2 藏药久美2号在体内对小鼠继发性多房棘球蚴病的作用观察

1.2.2.1 小鼠继发性多房棘球蚴病体内模型建立

将已感染多房棘球蚴的小鼠处死后，放置于75%酒精中浸泡60 s，取出后立即用无菌纱布擦拭干净，并放置于无菌操作台中，用已灭菌的镊子和剪刀在小鼠腹腔中取出多房棘球蚴的病灶组织，放置于已加入青霉素(60μg/mL)、链霉素(100μg/mL)的PBS缓冲液中，用已灭菌的眼科剪剪碎，制成原头蚴浓度为3000个/mL的悬液，然后取32只健康小鼠，经腹腔注射已配好的等浓度的原头蚴悬液(0.2mL/只)。

1.2.2.2 治疗剂量计算及药物处理

取人用药剂量的12倍作为小鼠的治疗剂量。将藏药久美2号(0.6g/kg·d)、阿苯达唑(0.24g/kg·d)两种药物与无菌纯水充分混合后进行超声破碎。

1.2.2.3 药物治疗

将32只小鼠分成四组，每组8只，分别为久美2号组、阿苯达唑组、模型对照组及空白对照组。用小鼠灌胃针以0.15 mL/10 g·d的剂量对各组小鼠进行灌胃治疗，连续90 d。

1.2.2.4 藏药久美2号和阿苯达唑连续用药90 d后对小鼠多房棘球蚴病灶组织湿重和病灶囊重抑制率的计算

通过眼球取血法收取小鼠血液，完毕后处死小鼠并放置于75%酒精中，浸泡约1 min，待取出小鼠后立即用无菌纱布擦拭干净，置于无菌操作台中。直视下剖开小鼠腹腔，游离并取多房棘球蚴组织， 测定病灶组织的重量， 计算小鼠多房棘球蚴的囊重抑制率[多房棘球蚴囊重抑制率(%)=(对照组多房棘球蚴囊重-治疗组多房棘球蚴囊重)/对照组泡球蚴囊重×100 %]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 久美2号在体外对小鼠继发性多房棘球蚴病原头蚴的作用观察

三组不同时间原头蚴死亡率的比较差异有统计学意义(P<0.001)，组别有统计学意义(P<0.001)，时间与组别的交互作用有统计学意义(P<0.001)。

组间分析，第1、3、6 d时，三组差异无统计学意义(P>0.05)；第12 d时，三组差异有统计学意义(P<0.05)，进一步做两两比较可知，16.0 mg/mL组高于其他三组，差异有统计学意义(P<0.05)，8.0 mg/mL组高于对照组和1.6 mg/mL组，差异有统计学意义(P<0.05)，对照组和1.6 mg/mL组差异无统计学意义(P>0.05)。第18 d时，三组差异有统计学意义(P<0.05)，进一步做两两比较可知，对照组明显低于其他三组，差异有统计学意义(P<0.05)，16.0 mg/mL组和8.0 mg/mL组明显高于1.6 mg/mL组，差异有统计学意义(P<0.05)，16.0 mg/mL组和8.0 mg/mL组差异无统计学意义(P>0.05)。

组内分析，对照组与16.0 mg/mL组、8.0 mg/mL组、1.6 mg/mL组不同时间点差异均有统计学意义(P>0.05)。进一步做两两比较可知，对照组表现为第1 d明显低于第3、6、12、18 d(P<0.05)，第3 d明显低于第12 d和第18 d(P<0.05)，其他两两时点间差异均不具有统计学意义(P>0.05)；16.0 mg/mL组、8.0 mg/mL组、1.6 mg/mL组均表现为第18 d>第12 d>第3 d和第6 d>第1 d，差异都有统计学意义(P<0.05)，第3 d和第6 d差异无统计学意义(P>0.05)。

组别n第1 d第3 d第6 d第12 d第18 dFP对照组312.33±2.8921.33±2.52a25.67±1.53a29.67±2.52ab34.00±5.00ab24.8680.008久美2号(16mg/mL)组312.33±2.8928.33±2.08a29.33±3.51a50.67±3.51abcA66.67±2.89abcdA121.080<0.001久美2号(8mg/mL)组312.33±2.8926.67±4.73a28.67±1.53a42.67±1.53abcAB57.67±7.23abcdA54.5190.016久美2号(1.6mg/mL)组312.33±2.8925.67±1.53a27.00±5.29a33.67±1.53abcBC48.33±3.51abcdABC48.0500.008F <0.001 3.031 0.731 45.429 23.846 - -P 1.000 0.093 0.562 <0.001 <0.001 - -

a：与第1 d比较，P<0.05；b：与第3 d比较，P<0.05；c：与第12 d比较，P<0.05；d：与第12 d比较，P<0.05；A：与对照组比较，P<0.05；B：与16.0 mg/mL组比较，P<0.05；C：与8.0 mg/mL组比较，P<0.05。

图1 培养18d期间对照组与不同浓度药物组原头蚴死亡率的比较图

A：对照组3 d后观察结果；B：8.0 mg/mL组干预3 d后观察结果；C：16.0 mg/mL组干预6 d后观察结果；D：1.6 mg/mL组干预12 d后观察结果；E：8.0 mg/mL组干预12 d后观察结果；F：16.0 mg/mL组干预12 d后观察结果；G：对照组18 d后观察结果；H：8.0 mg/mL组干预18 d后观察结果；I：16.0 mg/mL组干预18 d后观察结果。图中→ 表示失去正常形态的原头蚴。

图2光镜下不同浓度药物干预后原头蚴的形态图(40×)

Figure2MorphologicalmapoftheProtoscolexofechinococcusmultilocularisafterinterventionwithdifferentconcentrationsunderlightmicroscope(40×)

图2为光镜下不同浓度药物干预组原头蚴的形态，A图可以看到正常原头蚴形态(活动正常，胞体饱满，被摸完整，顶突存在，钩体结构正常，微毛排列整齐)；8.0 mg/mL组干预3 d后(B图)原头节胞体皱缩数量明显增多；16.0 mg /mL组干预6 d(C图)、1.6 mg/mL组干预12 d(D图)、8.0 mg/mL组干预12 d后(E图)原头蚴胞体皱缩数量明显增多的同时，死亡率也较对照组有明显差异；16.0 mg/mL组干预12 d后(F图)除了原头蚴死亡数量增多、胞体皱缩增多外，还可看到大量的钙粒漏出；在16.0 mg/mL组干预18 d后(I图)其视野内已经看不到正常形态的原头蚴，除之前观察的结果外，还发现有大量的胞体碎片和钙小体，顶突上的钩体排列紊乱，基本脱落，微毛排列紊乱，其中少量原头蚴虽失去了正常原头蚴形态，但在台盼蓝染色过程中拒染，所以未被视作死亡原头蚴。

2.2 久美2号在体内对小鼠继发性多房棘球蚴病的作用观察

久美2号和阿苯达唑连续用药90 d后小鼠多房棘球蚴病灶组织湿重和病灶囊重抑制率的计算结果如表2～3所示。久美2号组和阿苯达唑组连续用药90 d后与模型对照组相比较：在小鼠体内多房棘球蚴病灶组织湿重的数值上的差异都有统计学意义，而且其中久美2号组和模型对照组相比差异存在显著统计学意义(P=0.0039，P<0.01)，阿苯达唑组与模型对照组相比差异有统计学意义(P=0.0164，P<0.05)，久美2号组与阿苯达唑组相比差异无统计学意义(P=0.2053)；在小鼠多房棘球蚴病灶囊重抑制率方面，久美2号组和阿苯达唑组比较差异无统计学意义(P=0.2103)；三组多房棘球蚴湿重差异有统计学意义(P<0.05)，进一步做两两比较可知，藏药久美2号组、阿苯达唑组明显低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，藏药久美2号组与阿苯达唑组差异无统计学意义(P>0.05)。

Table 2Comparison of wet weights of three groups of

*：与久美2号组比较，P<0.05；#：与阿苯达唑组比较，P<0.05。

藏药久美2号组、阿苯达唑组分别有4例、3例抑制，抑制率分别为57.1%和42.9%，两组抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。

表3两组囊重抑制率比较结果[n(%)]

Table 3Comparison of cystic weight inhibition rates in two groups[n(%)]

3 讨论

AE是多房棘球蚴所致的一种严重的人畜共患寄生虫病。高发于青海省三江源和四川交界地域，其具有发病范围广、恶性程度高、预后效果差的特点。目前用于治疗AE的有效药物很少，主要为甲苯咪唑、阿苯达唑，但因其溶解性差，肠道吸收率及生物利用度低，疗效不稳定，治疗效果不尽人意。在传统医学领域，很多研究者做了一些这方面的探索，王轶等人[4]研究发现，川穹嗪联合阿苯达唑治疗小鼠继发性多房棘球蚴病，发现对多房棘球蚴有明显的抑制效果，而且两者联合使用比单独使用效果更佳，证明两者间有协同治疗作用。李小娟[5]研究发现，蒿甲醚在体外也对多房棘球蚴原头蚴有一定的破坏作用；陈根等人[6]研究发现，汉防己甲素和阿苯达唑可单独或联合用药于小鼠继发性泡球蚴病，在联合使用的时候，汉防己甲素能有效增强阿苯达唑的效果，两者具有一定的协同作用；张睿等人[7]研究发现，苦参碱对小鼠继发性多房棘球蚴病有一定的治疗作用，并能增强阿苯达唑对小鼠继发性多房棘球蚴病的疗效。还有学者研究发现青蒿琥酯联合阿苯达唑脂质体抑制包虫的复发作用不佳[8]。

本研究首次从体内、体外综合水平验证了藏药久美2号对抗多房棘球蚴及原头蚴生长的抑制作用，证明此药物对多房棘球蚴病有一定的疗效，并且在体内对小鼠继发性多房棘球蚴的抑制作用明显优于阿苯达唑。由于实验经费有限，未能以电镜下所观察结果来进一步验证此藏药对原头蚴的作用。未来我们将进一步完善实验，证明此药对多房棘球蚴病具有疗效的同时，对其可能的作用机制进行深入探讨。