黑果枸杞多糖对中波紫外线诱导HaCaT细胞增殖活性及P16蛋白表达的影响※

王睿智，任立汆，加杨娥，燕华玲#

(1.青海大学附属医院皮肤科；2.西藏民族大学附属医院；3.重庆市璧山区人民医院)

对黑果枸杞多糖(LyciumRuthenicumMurr.polysaccharide)的研究主要集中在其抗氧化、抗衰老、免疫调节等方面[1-3]。本文通过观察经黑果枸杞多糖处理过的HaCaT细胞，及其对UVB辐射后的增殖活力和p16蛋白表达水平的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

黑果枸杞，经青海大学药理教研室鉴定，为柴达木野生黑果枸杞。HaCat细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司；BCA蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG二抗购自北京普利莱基因技术有限公司；p16(Abcam，ab51243)单克隆抗体购自英国abcam公司；ECL化学发光试剂检测试剂盒购自北京Solarbio科技有限公司；飞利浦TL20W/12紫外线UVB灯管购自上海杰图商贸有限公司；UVB辐照度监示器购自台湾路昌公司；X-Mark型BIO-RAD酶标仪购自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.2 HaCaT细胞的培养及分组：将细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置培养箱中(37℃、5% CO2)培养，细胞达90%融合度时，将HaCaT细胞随机分为3组，对照组：不接受UVB辐射；UVB辐射组：予30 mJ/cm2的UVB辐射；UVB组(30mJ/cm2)+黑果枸杞多糖组：加入黑果枸杞多糖(2mg/mL)6 h后移除各组中的培养基，用少量PBS冲洗2次，再加入少量PBS覆盖后进行辐射(30mJ/cm2UVB)。辐射后置于DMEM培养基中继续培养12 h。

1.2.3 细胞增殖检测：用MTS法检测细胞增殖。每孔中加入MTS溶液20 μL，置于培养箱(37℃、5% CO2)中，继续孵育3 h。终止培养后，在490 nm 波长处测定各孔吸光度并记录结果。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 细胞活力

表1显示，UVB辐射后细胞活性下降，具有统计学意义(P<0.05)，说明UVB辐射可诱导HaCaT细胞发生凋亡。经黑果枸杞多糖干预后的HaCaT细胞活性升高，具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 p16蛋白表达水平

图1及表2显示，UVB辐射组及UVB辐射+黑果枸杞多糖组的p16蛋白表达均升高，但UVB辐射+黑果枸杞多糖组不如单纯UVB辐射组明显，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示黑果枸杞多糖具有抑制UVB诱导的p16蛋白表达升高的作用。

Table 1HaCaT cells proliferative activity in each

☆：表示与对照组相比，UVB辐射组HaCaT细胞增殖活性下降(P<0.05)；＊：表示与UVB辐射组比较，UVB辐射+黒果枸杞多糖组的HaCaT细胞增殖活性上升(P<0.05)。

☆：Show that compared with control group，HaCaT cell proliferative activity decrease in UVB-irradiated group(P<0.05)；*：Show that compared with UVB-irradiated group，a increase in UVB-irradiated+LyciumRuthenicumMurr.polysaccharide group(P<0.05).

1：对照组；2：UVB辐射组；3：UVB辐射+黑果枸杞多糖组

1：control group；2：UVB-irradiated group；3：UVB-irradiated+LyciumRuthenicumMurr.polysaccharide group

图1黑果枸杞多糖对UVB辐射诱导HaCat细胞p16蛋白表达的影响图

Figure1TheeffectofLyciumRuthenicumMurr.polysaccharideonUVB-inrradiatedHaCatcellsp16proteinexpression

Table 2Protein expression levels of p16 in each

注：与对照组相比，UVB辐射组及UVB辐射+黑果枸杞多糖组中p16蛋白表达升高(P<0.05)；与UVB辐射组相比，UVB辐射+黑果枸杞多糖组p16蛋白表达下降(P<0.05)。

Note：Compared with control group，protein expression of p16 in HaCaT cells.increase in UVB-irradiated group，and UVB-irradiated+LyciumruthenicumMurr.polysaccharide group(P<0.05)；compared with UVB-irradiated group，a decrease in UVB-irradiated+LyciumruthenicumMurr.polysaccharide group(P<0.05).

图2 各组HaCaT细胞P16蛋白的表达水平比较图

3 讨论

UVB(290～320nm)是导致皮肤光老化的最主要因素，UVB穿透能力较差。由角质形成细胞(HaCat细胞)组成的表皮层是皮肤最外层的结构，所以HaCat细胞即成为UVB最主要的靶细胞。长期过量的UVB辐射至皮肤表面时，被最表层的HaCat细胞吸收，并在其线粒体内产生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，ROS可抑制超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶活性，使其清除ROS能力大大降低，进一步导致ROS堆积，造成ROS的产出和清除的失衡，高浓度的ROS可破坏DNA的结构而引发DNA损伤应答[7]，或者直接调控衰老相关信号通路[8]，促进细胞衰老的发生。本研究模拟自然光照射至地面的强度(30mJ/cm2)建立细胞损伤模型。结果显示，经UVB辐射后的HaCat细胞增殖活性明显降低，推测UVB辐射HaCat细胞后发生氧化应激(reactive oxygen )，产出大量ROS引发了DNA损伤应答机制，导致细胞周期停滞，抑制细胞增殖。本研究所选生长在青海省柴达木盆地的黑果枸杞富含丰富的黑果枸杞多糖。与普通红果枸杞相比，黑果枸杞中多糖含量(4.201mg/g)显著高于红果枸杞的多糖(2.582mg/g)含量。[1]加杨娥等研究发现枸杞多糖可通过上调SOD、CAT等抗氧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量及下调丙二醛(MDA)水平来降低UVB导致的过氧化现象，进而缓解氧化损害，提高细胞增殖活性。[9]本实验结果显示，预先加入黑果枸杞多糖干预的HaCat细胞增殖活性较UVB组，所受影响相对较小，提示黑果枸杞多糖可促进UVB辐射后HaCat细胞增殖。

p16蛋白由定位于9p21的INK4a/ARF基因编码，其N端具有与细胞周期蛋白cyclin D同源结构，能与cyclin D竞争结合细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(cyclin-dependent kinase，CDK4/6)，影响CDK4/6视网膜母细胞瘤蛋白(Rb蛋白)的磷酸化及接下来转录因子E2F的激活，阻止细胞周期通过G1/S监测点，使细胞周期停滞[8]。另有研究发现，p16蛋白的高表达并不单一地通过Rb发生作用，在应激情况下，p38基因和p16基因的表达具有相关性[9]。Ito等[10]研究表明，UVB诱导的氧化应激产物ROS可激活p38MAPKs信号通路，上调p16和p19ARF的表达，限制小鼠造血干细胞的自我更新能力。本实验中，对照组仅表达少量p16蛋白，经UVB辐射后的HaCat细胞p16蛋白表达显著增加，黑果枸杞多糖预处理后的HaCat细胞p16蛋白表达则明显下调，推测UVB辐射后的HaCat细胞中有大量ROS堆积，从而激活p38MAPKs信号通路，继而上调p16蛋白表达，致其表达升高，激活CDK4/6促进Rb蛋白磷酸化使HaCat细胞有丝分裂停滞在G1/S期，加速细胞衰老进程。此结果与刘凌[11]等研究结果一致。黑果枸杞多糖可能通过抑制氧化应激反应清除ROS堆积，同时阻断p38MAPKs信号通路，下调p16蛋白表达，从而达到减轻光老化的目的。

综上所述，黑果枸杞多糖可对抗UVB对HaCat细胞造成的光老化损伤，并通过下调p16蛋白的表达提高细胞增殖活性。