探讨二甲双胍对T2DM患者外周血白细胞NF—κB和IL—1β的抑制作用

许晓玲

【摘要】 目的：检验二甲双胍应用是否影响T2DM患者外周血白细胞NF-κB和IL-1β的表达。方法：本研究募集汕头大学医学院第一附属医院内分泌科2015年11月-2016年10月收住的T2DM患者117例，根据使用二甲双胍与否分为对照组（未用二甲双胍）和二甲双胍组（口服二甲双胍，500～2 000 mg/d）。收集所有患者的外周血标本以检测外周血白细胞（PBLs）数量、生化参数和C肽。并从PBLs中分离取得总mRNA。半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）用于检测PBLs中NF-κB和IL-1β的表达。结果：二甲双胍组空腹血糖、糖基化血红蛋白、低密度脂蛋白胆固醇均明显低于对照组，2小时C肽高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），而两组总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和PBLs比较差异无统计学意义（P>0.05）。相比对照组，二甲双胍组FBG、HbA1c和LDL-C水平较低，而2 h C肽较高（P<0.05）。二甲双胍组NF-κB和IL-1βmRNA表达水平显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：结果显示二甲双胍不止改善血糖、血脂及胰岛素β细胞分泌功能，还通过抑制NF-κB/IL-1β信号通路而在T2DM患者中发挥抗炎作用，这为二甲双胍在T2DM的抗炎益处提供了证据。

【关键词】 2型糖尿病； NF-κB； IL-1β； 二甲双胍

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.16.009 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2018）16-00-04

The Discussion about the Effect of Metformin on the Expression of NF-κB and IL-1β in Peripheral Blood Leukocytes from Patients with Type 2 Diabetes/XU Xiaoling.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（16）：-23

【Abstract】 Objective：To test whether metformin application affected peripheral blood leukocyte NF- B and il-1 in T2DM patients.Method：In this study，117 cases of T2DM patients in the department of endocrinology of the First Affiliated Hospital of Shantou University were collected from November 2015 to October 2016.According to the use of metformin，they were divided into the control group （without Metformin） and Metformin group （oral Metformin，500～2 000 mg/d）.

Peripheral blood samples were collected from all the patients for testing PBL counts，biochemicalparametersand C peptide.Total RNA was isolated from PBLs.RT-PCR was used to examine the expression of NF-κB and IL-1β in PBLs.Result：The fasting blood glucose，glycosylated hemoglobin and LDL cholesterol in metformin group were significantly lower than those in the control group，2 h C-peptide level was higher than that in control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.The expression of NF- κ B and IL-1 β mRNA in metformin group was significantly lower than that in control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The results showed that metformin not only improved blood glucose，blood lipid and insulin β cell secretion，but also played an anti-inflammatory role in T2DM patients by inhibiting NF- κ B/IL-1 β signaling pathway，which provided evidence for the anti-inflammatory benefits of metformin in T2DM.

【Key words】 Type 2 diabetes； NF-κB； IL-1β； Metformin

First-authors address：Shantou Chaonan Minsheng Hospital，Shantou 515144，China

研究顯示T2DM是一种自身炎症性疾病[1]。NF-κB/IL-1β炎症信号通路在T2DM中发挥重要作用[2]，可能成为T2DM抗感染治疗的潜在靶点，然而以炎症作为靶点的治疗还未应用于临床。有趣的是，现今用于降糖的药物，一些具有抗炎活性，这可能有助于改善临床结局。二甲双胍是临床治疗T2DM的一线、基础药物，不止改善高血糖症和胰岛素抵抗，也具有抗炎、抗肿瘤和抗老化作用，并改善其他的心血管风险因素，如超重状态或肥胖、致动脉粥样硬化血脂异常、高血压、促凝状态和颈动脉内膜厚度[3]。研究显示二甲双胍治疗IGT患者能减少单核细胞和淋巴细胞各种促炎因子的释放[4]。二甲双胍应用是否影响T2DM患者细胞NF-κB和IL-1β的表达，这需要进一步印证。因此，笔者将T2DM患者分为二甲双胍组及对照组，观察二甲双胍应用对T2DM患者外周血白血病NF-κB/IL-1β信号表达的作用，并阐述其潜在的抗炎作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究募集汕头大学医学院第一附属医院内分泌科2015年11月-2016年10月收住的T2DM患者117例，诊断符合1999年WHO糖尿病诊断标准，排除糖尿病急性并发症和其他严重的系统性疾病。根据使用二甲双胍与否，分为对照组（未用二甲双胍）及二甲双胍组（二甲双胍500～2 000 mg/d）。对照组54例，男28例，女26例，年龄22～71岁，平均（53.22±10.70岁）；二甲双胍组63例，男27例，女36例，年龄42～80岁，平均（61.08±7.78岁）。两组患者一般性资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本临床研究已通过医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 PBLs分离 取新鲜外周抗凝血3～15 ml离心管中，400～500 g离心5 min，弃上清。加入6～10倍细胞体积的红细胞裂解液（KHCO3 1.0 g，NH4C 18.3 g，EDTA-Na 0.037 g，加水至1 000 ml），轻轻吹打混匀，裂解4～5 min。400～500 g离心5 min，弃红色上清。重复裂解一次。加入适量PBS（至少为细胞沉淀体积的5倍）洗涤1～2次，重悬沉淀，400～500 g离心2～3 min，弃上清。得到白细胞沉淀，用于提取總mRNA。

1.2.2 PBLs内总mRNA的提取 根据TaKaRa Total RNA提取试剂盒的要求和配置，提取白细胞总RNA，用于RT-PCR实验。

1.2.3 RT-PCR检测PBLs中NF-κB和IL-1βmRNA表达水平 用所提取的白细胞总RNA合成cDNA一链（EasyScript First-Stand cDNA Synthesis SuperMix Kit Promega Biotech），进行PCR扩增（2*Taq PCR MasterMix kit TIANGEN Biotech）。PCR循环：94 ℃，3 min；循环28次（94℃，30 s；59 ℃，30 s；72 ℃，1 min）；最后72 ℃，10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统拍照，Quantity-one软件分析计算条带灰度值，GAPDH作为内参。引物序列见表1。

1.3 观察指标

比较两组空腹血糖（FBG）、糖基化血红蛋白（HbA1c）、2 h

C肽（2 h C-P）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）、外周血白细胞（PBLs），以及两组NF-κB/GAPDH和IL-1β/GAPDH表达水平等。

1.4 统计学处理

统计学分析应用SPSS 16.0统计软件，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用两组非独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料检查结果比较

二甲双胍组空腹血糖、糖基化血红蛋白、低密度脂蛋白-胆固醇均明显低于对照组，2 h C肽高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），而两组总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白-胆固醇和PBLs比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.2 两组NF-κB/GAPDH和IL-1β/GAPDH表达水平比较

二甲双胍组NF-κB和IL-1βmRNA表达水平均显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3、图1。

3 讨论

研究证明，炎症在T2DM的发病机制中发挥着重要的作用[5]。横断面和前瞻性的研究显示在肥胖和T2DM中具有高水平的急性时相标志物（包括C-反应蛋白、血清淀粉样-A和唾液酸）、白细胞、血浆凝固因子（纤维蛋白和纤溶酶原活化剂抑制剂-1）、促炎因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）和趋化因子[6]。在胰腺胰岛，局部炎症能减少胰岛素释放和触发β-细胞凋亡，导致胰岛质量下降，而这在T2DM病情进展中发挥关键作用[7]。因此，炎症在T2DM的病理机制中发挥重要作用。

NF-κB在调节炎症中发挥重要作用。在静息状态，NF-κB通过结合于细胞中kappa轻链多肽基因增强子抑制剂a（IkBa）而定位于胞浆。当细胞受到炎症等刺激时，kappa轻链多肽基因增强子抑制剂激酶b（IKKb）激活，磷酸化IkBa蛋白并使其降解，NF-κB得以被释放并进入细胞核，通过结合特定的基因启动子和增强子kB序列而转录激活一系列的炎症基因[8]。研究显示T2DM患者肌肉细胞IκBa含量降低，这提示增强的NF-κB信号[9]。NF-κB激活后，可增强TNF-a和IL-1β等的基因转录，促使其产生和释放增加，后者又导致NF-κB的进一步激活，构成一个正反馈回路，造成不断恶化的促炎症反应环境。

IL-1β是研究的最多的IL-1家族成员，因为其在介导自身炎症性疾病中的作用[10]。研究发现，游离脂肪酸包括油酸、棕榈酸和硬脂酸等可以刺激胰岛Beta细胞产生IL-1[11]。而且IL-1可以刺激自身的表达，构成一个严重的恶性循环[12]。

综上所述，NF-κB/IL-1炎症信号通路在T2DM中发挥重要作用，使其可能成为潜在的治疗靶点以对抗T2DM疾病炎症诱导的损伤。

二甲双胍是治疗2型糖尿病的基础、一线、全程药物，主要通过抑制肝脏糖异生而改善高血糖症，同时提高肝脏和外周组织的胰岛素敏感性[13]。前期研究显示，除了在糖代谢中的作用，二甲双胍也调节脂质代谢和发挥抗炎作用。血管内皮细胞实验显示二甲双胍通过活化AMPK而抑制NF-κB活性，从而减轻细胞因子诱导的促炎因子和粘附分子基因的表达[14]。另外，在动脉粥样硬化斑块分离出的人类血管平滑肌细胞、巨噬细胞和上皮细胞中，二甲双胍通过抑制NFκB 活性而抑制IL-1β诱导的IL-6和IL-8的释放[15]。在实验性动脉粥样硬化家兔的大动脉血管壁细胞中，二甲双胍抑制IκB磷酸化和NF-κB活化，提示其潜在的抗炎特性。

在本研究中，二甲雙胍显著降低T2DM患者的FBG和LDL，提高2 h C肽水平，并抑制PBLs中NF-κB和IL-1β的mRNA表达水平，这与前期细胞和动物实验中的研究结果是相符合的。研究提示二甲双胍不止改善血糖、血脂及胰岛素β细胞分泌功能，还通过抑制NF-κB/IL-1β信号通路而在T2DM患者中发挥抗炎作用，这为二甲双胍在T2DM的抗炎益处提供了证据。

参考文献

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（收稿日期：2017-11-28）