NLRP3炎性小体对冠心病患者血浆IL-1β、IL-18、TGF-β水平的影响*

胡龙江，周音频△，曹运兰，吕 湛，蓝运竞，宁 琳，向立权，肖 鹏

(1.重庆市涪陵中心医院心血管内科 408000；2.贵州省人民医院心血管内科，贵阳 550002；3.川北医学院附属医院心血管内科，四川南充 637000)

随着人民生活水平的不断提高，心血管疾病的发病率逐年增加，特别是在发达国家及部分发展中国家。因此，进一步明确心血管疾病的发病机制及寻找新的心血管疾病防治策略迫在眉睫。有研究表明，局部和全身炎症反应及自身免疫在心血管疾病发生发展过程中起着重要作用[1]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (NLRP3)炎性小体是一种包含NLRP3、凋亡相关微粒蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的蛋白质复合体,在机体正常免疫反应过程中起重要作用，是炎症-免疫的桥梁，在心血管疾病中的作用是当前研究的热点[2-3]，它能促进炎性因子白细胞介素(IL)-1β、IL-18的产生[4]，参与多种心血管疾病的发生发展，而当IL-1β、IL-18作为炎性因子参与机体炎症反应，机体抗炎因子如TGF-β亦会发生相应变化。本研究通过检测冠心病患者外周血单个核细胞(PBMCs)中NLRP3炎性小体的表达情况及血浆IL-1β、IL-18、转化生长因子-β(TGF-β)的水平变化，进一步探讨NLRP3炎性小体与冠心病发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2016年3-9月重庆市涪陵中心医院健康体检中心的健康体检者30例(对照组)，心血管内科收治的冠心病患者60例(冠心病组)，年龄均在40～80岁，对照组肝、心、肾、肺检查均正常，排除自身免疫性疾病、代谢性疾病、急慢性感染性疾病、近期创伤、肿瘤、正在使用抗炎药物者，排除有遗传病及传染病家族史者。冠心病组符合患冠心病诊断依据(行冠状动脉造影术证实)，排除移植血管病变者，排除严重心、肝、肾功能不全等慢性并发症者，余排除标准同对照组。该研究获重庆市涪陵中心医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1基本临床资料采集 研究对象入组后，统计性别、年龄、吸烟史、平均动脉压(MAP)、体质量指数(BMI)、空腹血糖(FPG)、血脂等临床资料，所有研究对象入组后次日06:00时抽取外周静脉血20 mL，取4 mL全血离心，抽取血浆，置于-80 ℃冰箱中备用，剩余全血，注入肝素抗凝管，Ficoll-Hypaque密度梯度分离出PBMCs。

1.2.2RNA提取及逆转录 采用RNAiso plus试剂盒提取人PBMCs总RNA，测定其浓度并检测纯度。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit进行逆转录合成cDNA，引物序列由TaKaRa公司合成，见表1。

1.2.3RT-qPCR反应 应用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ荧光定量试剂盒进行实时定量PCR反应，反应体系及条件参照说明书，反应结束后，作扩增及溶解曲线，采用Ct值计算目的基因的相对表达量：ΔΔCt=(Ct病例组-CtGAPDH)-(Ct对照组-CtGAPDH)，病例组目的基因mRNA的相对表达量=2-ΔΔCt。

1.2.4Western blot 按照Western blot及IP细胞裂解液提取PBMCs总蛋白，并采用BCA法测定蛋白浓度。取40 μg蛋白进行8%SDS-PAGE凝胶电泳，裁膜，转膜，BSA-TBS封闭液封闭4 h，浸入含蛋白NLRP3(1∶100)、ASC(1∶1 000)，caspase-1(2.5 μg/mL)、内参蛋白GAPDH(1∶500)的一抗稀释液中，在 4 ℃孵育过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)，在室温孵育1 h，洗膜，凝胶成像分析系统显影分析。

1.2.5ELISA检测 应用ELISA法测定血浆IL-1β、IL-18、TGF-β水平，严格参照说明书进行操作。

2 结 果

2.1两组基本资料及血脂、血糖水平比较 两组性别、吸烟、年龄、BMI、FPG、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TCH)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDLC)、差异无统计学意义(P>0.05)；MAP在冠心病组高于对照组，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)在对照组高于冠心病组(P<0.05)，见表2。

2.2两组血浆IL-1β、IL-18、TGF-β水平变化比较 IL-1β、IL-18、TGF-β在冠心病组高于对照组(P<0.05)，见表3。

2.3两组NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA水平比较 PBMCs中ASC mRNA在冠心病组中的表达高于对照组(P<0.05)，见图1。

表1 引物序列

表2 两组间基本情况及血脂、血糖水平变化比较

表3 两组血浆IL-1β、IL-18、TGF-β水平变化比较

*：P<0.05，与对照组比较

图1两组NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA水平比较

2.4两组NLRP3、ASC、caspase-1水平比较 PBMCs中NLRP3、ASC、caspase-1在冠心病组中的表达高于对照组(P<0.05)，见图2、3。

*：P<0.05，与对照组比较

图2两组NLRP3、ASC、caspase-1蛋白水平比较

图3 两组Western blot检测结果

2.5两组NLRP3、ASC、caspase-1及其mRNA与其余各观察指标相关分析 对照组caspase-1 mRNA与FPG呈正相关(r=0.394，P=0.031)，NLRP3与性别呈正相关(r=0.429，P=0.020)，ASC与FPG呈正相关(r=0.405，P=0.026)，caspase-1与MAP、FPG呈正相关(r=0.447、0.396，P=0.013、0.030)；冠心病组，NLRP3 mRNA和caspase-1 mRNA均与IL-18呈正相关(r=0.327、0.274，P=0.011、0.031)，ASC与年龄、IL-1β、IL-18呈正相关(r=0.370、0.467、0.403，P=0.024、0.009、0.027)；caspase-1与吸烟、IL-18呈正相关(r=0.613、0.414，P<0.01,P=0.023)。

2.6IL-1β、IL-18、TGF-β之间相关分析 Spearman相关分析显示IL-1β、IL-18、TGF-β在对照组无相关性；而在冠心病组，IL-1β与TGF-β呈负相关(r=-0.287，P=0.026)。

3 讨 论

动脉粥样硬化是一种慢性、渐进性炎性疾病，炎症反应在动脉粥样硬化的发生、发展及粥样斑块的破裂、继发性血栓的形成过程中发挥着重要作用。在冠心病患者中，粥样硬化斑块是贯穿于冠心病的关键点。同样，炎性反应促进冠心病的发生发展及急性冠状动脉综合征的发生。NLRP3炎性小体具有调控机体慢性炎症反应的功能，NLRP3 是其最核心的组成部分，包括中间的核苷酸寡聚结构域、C 端的亮氨酸重复序列及N 端的热蛋白结构域，ASC是其衔接蛋白，与NLRP3 及caspase-1前体结合，并介导NLRP3激活caspase-1，而caspase-1 是其效应蛋白，它被激活后促使促炎因子如IL-1β和L-18的前体转化为活性形式[4-5]。

IL-1β 是经典的炎性因子，参与动脉粥样硬化相关的免疫与炎性反应，在冠心病的发生发展及斑块的破裂过程中起着重要作用[6]，其机制包括：促进血管平滑肌细胞迁移及增殖[7]；促进血管内皮细胞增生及细胞外基质沉积；促进泡沫细胞形成；上调CD40 及其配体的表达[8]；促进免疫反应及免疫调节；促进动脉血栓形成。

IL-18是“多效能”炎性因子，在免疫及炎性反应过程中扮演着重要角色，它不仅通过诱导INF-γ的生成；诱导血管平滑肌细胞的增殖和迁移及血管内皮细胞的凋亡；促进泡沫细胞的形成；刺激血管壁细胞IL-1β、IL-8等细胞因子的表达；促进单核巨噬细胞基质金属蛋白酶的表达及凋亡等机制促进冠心病的发生发展，而且增加动脉粥样斑块的不稳定性[9]，促进易损斑块的形成，参与易损斑块的溃疡、破裂、血栓的形成[10]。IL-18是冠心病的独立危险因子，并可对冠心病患者病情的发展及严重冠脉事件作出预测[11-12]。

TGF-β是具有多种生物学功能的多肽生长因子，在心血管系统中亦起重要作用。TGF-β具有抑制炎性反应的作用，而在动脉粥样硬化疾病中，TGF-β在机体过度表达，其通过多种途径使其对机体有利的生物学作用降低[13]，反而通过促进平滑肌细胞的增生、迁移、分化[14-15]；促进细胞外基质的合成与积聚，抑制细胞外基质的降解[13-14]；诱导血管重构[13-14]；促进血栓形成[14]；增加纤维帽厚度等机制促进冠心病的发生发展。

本课题组通过检测PBMCs中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA的表达，发现对照组PBMCs中ASC mRNA水平显著低于冠心病组，提示NLRP3 炎性小体在患者病患者中部分组分在转录水平即表达增加，为冠心病患者激活NLRP3 炎性小体奠定了基本条件。虽然NLRP3 及caspase-1 mRNA的表达在冠心病患者中未见明显增高，但均与IL-18呈正相关，提示NLRP3炎性小体在转录水平即有促进炎性因子IL-18表达的倾向。本课题组进一步提取PBMCs中总蛋白，并检测NLRP3炎性小体各组分浓度，同时测定IL-1β、IL-18、TGF-β在血浆中的水平，发现冠心病患者中NLRP3、ASC、caspase-1浓度及血浆IL-1β、IL-18、TGF-β水平均高于对照组(P<0.05)，提示PBMCs中NLRP3炎性小体以及血浆IL-1β、IL-18、TGF-β水平与冠心病的发生发展密切相关；且ASC在冠心病组与年龄、IL-1β、IL-18呈正相关，caspase-1在冠心病组与吸烟、IL-18呈正相关，IL-1β在冠心病组与TGF-β呈负相关，提示在冠心病患者中，发挥正常免疫功能的NLRP3 炎性小体的调控失去平衡性，它被激活后，导致促炎细胞因子IL-1β 、IL-18 过量生成，继而通过下游的信号转导通路产生炎性瀑布反应，导致冠状动脉炎性损伤。但在冠心病患者中，促炎因子IL-1β 和IL-18的表达并未直接促进抗炎因子TGF-β的表达，冠心病患者血浆TGF-β的高表达，与其他途径密切相关，本课题组将进一步研究。

综上所述，PBMCs中NLRP3炎性小体以及血浆IL-1β、IL-18、TGF-β水平与冠心病的发生发展密切相关，以NLRP3炎性小体为中心的NLRP3-ASC-caspase-1-IL-1β/IL-18信号通路可能在冠心病的发生发展过程中发挥重要作用，但该通路并未促进冠心病患者抗炎因子TGF-β的表达，血浆TGF-β高表达可能与其他途径密切相关。因此，进一步研究NLRP3-ASC-caspase-1- IL-1β/IL-18信号通路以及TGF-β的激活及调控机制，进而针对该通路及TGF-β的干预有可能成为防治冠心病潜在而有效的策略。