沉默HIF-1α基因逆转结肠癌MDR的研究*

杨光磊,胡岩芳,张 丛,许书清,彭林涛,葛国庆,胡延伟,王 钊,张仕东

(邢台市人民医院:1.普外科；2.神经内科，河北邢台 054031)

表1 HT-29 MCS的水平下各组目的蛋白表达的抑制情况对比

a：P<0.05，与B组对比；b：P<0.05，与D组对比；c：P<0.05，与E组对比；d：P<0.05，与C组对比

结肠癌为临床上较为常见恶性肿瘤，化疗对患者的疗效有重要影响，但患者不同化疗的方式间的敏感性有非常大的差异，患者的治疗效果不是很理想，而患者体内肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance,MDR)是其化疗失败的重要因素[1]。肿瘤细胞不仅对服用过的药物产生耐药性，还会对和原药物作用机制、结构完全不一样药物也发生较差的耐药性。相关研究显示，造成恶性的肿瘤患者死亡中有近95%都是和肿瘤的耐药有关联。在结肠癌患者机体内，肿瘤细胞的缺氧为正常的状况，在缺氧所导致肿瘤细胞的生物学特征变化中，缺氧的诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)在这个过程中有这重要影响。HIF-1α一般在肿瘤细胞内进行过度表达，和肿瘤患者预后也有密切联系，在缺氧的情况下还会使肿瘤细胞对抗肿瘤药物的抵抗性加大[2-3]。本文通过探讨沉默HIF-1α基因对结肠癌MDR逆转的影响，为临床患者的治疗提供一些新的思路。

1 材料与方法

1.1材料与试剂、仪器 (1)材料：人结直肠腺癌细胞HT-29细胞(通派上海生物科技有限公司)。(2)试剂：琼脂糖粉(美国Sigma公司)、胰酶(美国Hyclone公司)、长春新碱(VCR，浙江海正药业股份有限公司)、胎牛血清(FBS，民海生物公司)、二甲亚砜(DMSO，美国Sigma公司)、盐酸阿霉素(ADR，海正药业公司)、伊立替康(CPT-11，山东罗欣药业集团股份有限公司)、miR的重组慢病毒(美国Invitrogen公司)、5-氟尿嘧啶(5-Fu，上海旭东海普药业有限公司)。(3)仪器：CO2的培养箱(美国Thermo Forma公司)、酶标仪(型号：Bio-RAD Model 550，美国Biol-Tiok公司)、流式的细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。

1.2方法

1.2.1培养细胞 (1)常氧的培养：使用DMEM的高糖培养基对HT-29细胞进行培养，内含100 U/mL的链霉素、10%的FBS和100 U/mL的青霉素，使用0.3%的胰酶进行消化传代；(2)低氧的培养：向密封的容器内充进混合的气体(4% CO2、96% N2)，速度为10 L/min，连续10 min；(3)使用liquid overlay的技术对HT-29细胞进行三维的培养。

1.2.2Western blot法检查 使用Western blot法检查HT-29 MCS内HIF-1α的miR的重组慢病毒的干扰情况[4]：将HT-29 MCS的实验细胞分成5组，Neg-miR感染组(A组)、亲本HT-29 MCS未处理(常氧)组(B组)、MDR1 miR感染组(C组)、亲本HT-29 MCS未处理(低氧)组(D组)和HIF-1α miR感染组(E组)；分别进行3次实验，取其平均值当做最终的结果。

1.2.3检查细胞周期 检查低氧与常氧情况下HT-29 MCS的细胞周期[5]：把未处理亲本HT-29 的细胞分成低氧组与常氧组(即D组和B组)，待HT-29 MCS产生中等大小以后，加入无酶的消化液(每孔28 μL)，使MCS的细胞逐渐分散；使用PBS进行2次洗涤，使用流式的细胞仪进行检测。

1.2.4检查化疗的敏感性[6]将MDR1或HIF-1α miR的慢病毒感染HT-29细胞和亲本的HT-29细胞进行三维的培养建立HT-29 MCS，采用CPT-11、ADR、5-Fu和VCR检测其在低氧和常氧情况下的化疗的敏感性。

1.2.5各组HT-29 MCS的细胞死亡[7]使用流式的细胞检测仪对CPT-11、ADR、5-Fu和VCR影响后各组细胞的死亡情况。

2 结 果

2.1HT-29 MCS的水平下各组目的蛋白表达的抑制情况 HT-29 MCS的水平下各组目的蛋白表达的抑制差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2HT-29 MCS的细胞周期情况 D组、E组和C组与B组对比差异均有统计学意义(P<0.05)，E组与D组对比差异有统计学意义(P<0.05)，C组与E组对比差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 HT-29 MCS的细胞周期情况对比

a：P<0.05，与B组对比；b：P<0.05，与亲D组对比；c：P<0.05，与E组对比

2.3各组化疗的敏感性情况 D组(VCR、ADR、5-Fu)、C组(5-Fu)、E组(5-Fu)与B组对比差异有统计学意义(P<0.05)，E组(VCR、ADR、5-Fu)、C组(ADR、VCR)与D组对比差异有统计学意义(P<0.05)，C组(5-Fu)与E组对比差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.4各组HT-29 MCS细胞的死亡情况 D组(VCR、ADR、5-Fu)、C组(5-Fu)、E组(5-Fu)与B组对比差异有统计学意义(P<0.05)，E组(VCR、ADR、5-Fu)、C组(ADR、VCR)与D组对比差异有统计学意义(P<0.05)，C组(5-Fu)与E组对比差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表3 不同药物影响下各组IC50情况对比

a：P<0.05，与B组对比；b：P<0.05，与D组对比；c：P<0.05，与E组对比

表4 在药物的作用下HT-29 MCS细胞的死亡情况对比

a：P<0.05，与B组对比；b：P<0.05，与D组对比；c：P<0.05，与E组对比

3 讨 论

很多实体的瘤内的缺氧情况很常见，结肠癌患者的组织缺氧状况更加明显。肿瘤的细胞发生缺氧以后会产生代谢与遗传的变化，不但使细胞本身继续生存增殖，还会对很多化疗的药物产生耐受性，致使患者的疗效降低[8-10]。HIF-1在肿瘤细胞的缺氧反应中有重要作用，这使它成为扭转缺氧的肿瘤细胞疗效的新靶点。

本文中选取CPT-11、ADR、5-Fu及VCR当作沉默靶基因和低氧处理的前后检查化疗的敏感性药物，这几种药物都是临床上比较常见的，而且他们间的耐药影响和作用的机制各不相同。MDR1与HIF-1α的两套miR的重组慢病毒的干扰体系可以跟随细胞进行传代，不但在单层的HT-29的水平上对目的基因的表达进行沉默，还能够显著地对靶基因蛋白的表达产生抑制作用。本文研究中对各组细胞死亡状况，使用的Annexin V-APC/PI的检查系统，工作机理为在一般的细胞内，磷酯酰丝氨酸(PS)在细胞膜的脂质内侧有分布，但在前期细胞发生死亡时，细胞膜内PS会从内侧向外侧进行翻转。Annexin V为磷脂结合的蛋白，它和PS的亲和力比较强，可以与前期的细胞外侧PS进行结合[11-13]。本文研究发现，低氧能够使结肠癌患者的HT-29 MCS细胞对5-Fu、VCR和ADR发生显著耐药性，而且细胞的死亡率比正常情况下的要低。此后经过MDR1或者HIF-1α基因验证了HIF-1α受到了明显的抑制，HT-29 MCS细胞对5-Fu、VCR和ADR敏感性明显加强，药物的扭转率得到提升，药物引导下细胞的死亡率也显著提升，说明HIF-1α miR的干扰体系结合药物能够使耐药的细胞死亡，患者治疗效果提高。MDR1基因也受到了明显地抑制，HT-29 MCS细胞对VCR与ADR敏感性显著加强，药物的扭转率得到提升，药物引导下细胞的死亡率也显著提升，但对5-Fu没有明显的作用[14-15]。

综上所述，低氧能够使结肠癌的亲本HT-29 MCS出现MDR的表型，成为耐药的模型，沉默HIF-1α能够显著逆转HT-29 MCS细胞对5-Fu、VCR和ADR的耐药性。