微小核糖核酸:家族性高胆固醇血症的新治疗靶点

江龙综述，王绿娅、程晓曙审校

家族性高胆固醇血症（FH）是常染色体单基因显性遗传病，主要致病基因为低密度脂蛋白受体（LDLR）基因，其主要临床特征是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平极度升高，引起全身严重动脉粥样硬化（AS）和早发冠状动脉粥样硬化性心脏病[1，2]。FH分为纯合（HoFH）与杂合两种类型，杂合FH患病率约为1/200，HoFH患病率仅为1/16万～30万[3，4]。但FH的早期诊断率及治疗率仅为10%～15%[1]，作为冠心病的高危人群，目前仍未引起人们足够重视。FH与其他高脂血症不同，2013年欧洲动脉粥样硬化学会（EAS）共识强调了“累积LDL-C负担”的概念，正常人55 岁时累积LDL-C 负担为160 mmol/L即可发生冠心病（CHD），由于患者从出生就沉浸在高LDL-C水平下，若不治疗，HoFH患者12岁LDL-C就可累积到160 mmol/L而发生CHD，杂合FH患者35岁时即可发生CHD[1]。近年来，国际动脉粥样硬化学会、EAS等国际组织颁布多项FH防治指南和共识，强调需强化FH管理[3-5]。按照FH全球发病率1/200计算，我国有超过300万潜在FH患者，遗传负担相当沉重。2013年EAS制定的FH诊治共识认为我国大陆FH诊断率和治疗率非常低，甚至低于中国台湾和中国香港[1]。此外，我国FH研究现状系统评价显示，截止2014-12底，大陆报道FH总例数约100例，大多为病例报道和综述类研究[6]。中国作为世界上人口最多的国家，承受FH 遗传负担可能比其他国家更为严重。除开展必要的防治宣传外，对FH治疗方法的探索也是分子生物学重要的课题之一。

1 家族性高胆固醇血症基因治疗的探索

目前的药物治疗很难使FH患者的LDL-C水平达到指南建议的目标值，特别是HoFH患者，即使他汀联合依折麦布仅能降低LDL-C水平30%～40%[4]；新近报道的在他汀基础上加用前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）抑制剂可降低LDL-C水平约50%[7]；脂蛋白血浆置换术通过体外脂蛋白分离能够有效降低HoFH患者血液中LDL-C水平55%～70%，但需要每2周1次，和PCSK9抑制剂一样存在花费巨大的问题[8]；肝脏移植可改善HoFH患者的LDL代谢，但由于缺乏供体及免疫排斥反应而难以推广。因此，探索一种安全有效的新型疗法势在必行。

肝脏是调整胆固醇代谢的主要器官，人体约70%的LDL-C由肝脏上的LDLR基因代谢。因此，目前的FH基因治疗策略主要围绕肝脏上补充正常的人LDLR。最早在1995年，有学者通过逆转录病毒将表达人LDLR基因输入5例HoFH患者肝脏，令人失望的是仅有3例患者有轻度的LDL-C降低（6%～25%）[9]；有学者在动物模型中证实以腺相关病毒8（AAV8）为载体，携带重组LDLR基因至LdLr-/-/载脂蛋白B信使核糖核酸（mRNA）编辑的催化多肽-1（Apobec1）-/-小鼠模型肝脏，可有效改善AS进展[10]。基于此，在2016年开展了一项以AAV8为载体的对FH基因治疗临床试验（NCT02651675），目前效果尚未公布。但是病毒载体具有潜在的免疫源性以及细胞毒性作用，安全性方面还有待深入研究。此外，一些非病毒载体的基因疗法已在FH动物模型中验证了其有效性和安全性，如我国团队最近采用体积更小的微循环DNA载体装载正常的LDLR基因，导入到高脂饮食的C57BL/6 LdLr-/-小鼠体内，在15周左右小鼠LDL-C水平维持在2.3～3.9 mmol/L之间，且未检测到显著的毒性反应[11]。总之，FH的基因治疗策略的探索已经崭露头角，具有广阔的前景，但其临床疗效和安全性还有待深入的探索。

2 微小核糖核酸（miRNAs）或为治疗的新靶点

近年发现的miRNAs揭开了真核生物基因表达新的调控方式，极大地丰富了人们对基因表达调控新的认识。miRNAs是长度为18～22核苷酸的内源性非编码单链RNA，通过碱基互补配对的方式与靶基因3’端非翻译区结合，抑制靶基因mRNA转录、降解及抑制蛋白翻译[12]。以下将主要围绕miRNAs与LDL-C代谢以及目前与FH的临床研究进展逐一进行阐述（图1）。

2.1 miRNAs与LDL-C代谢

FH主要致病基因为LDLR，占75%以上；其他致病基因还包括载脂蛋白B100（ApoB100）和PCSK9等。以上任何一个基因有害突变，均可引起LDLR的表达和功能异常，导致循环LDL清除障碍，引发LDL-C水平升高，最终导致CHD发生。现围绕影响以上三个主要基因的miRNAs进行阐述。

LDLR基因相关的miRNAs：LDLR是体内LDL-C清除的关键受体，如能通过miRNAs提高自身LDLR的表达，将是一个潜在的治疗策略。目前体外细胞实验证实直接或间接影响LDLR基因表 达 的 miRNAs 包 括：miR-27a/b[13]、miR-128-1[14]、miR-148a[14]、miR-130b[14]、miR-301b[14]、miR-185[15]、miR-195[16]及 miR-199a/b[17]；而经过动物体内验证最终能有效影响LDL-C代谢的仅有以下三个：miR-128-1[14]、miR-148a[14]、miR-185[15]；在ApoE-/-的小鼠模型中抑制miR-128-1可显著升高LDLR的表达，降低循环极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）和LDL-C水平；在ApoE-/-的小鼠模型中抑制miR-148a可显著升高LDLR和腺苷三磷酸（ATP）结合盒转运体A1（ABCA1）的表达，从而减少循环中的LDL-C水平和升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平；在ApoE-/-的小鼠模型中抑制miR-185可明显降低循环LDL-C水平，并且延缓动脉粥样硬化的进展。

ApoB基因相关的miRNAs：载脂蛋白B（ApoB）的组装和分泌对于饮食和内源性来源的脂质运输至关重要，因此抑制ApoB的表达和活性，可有效的控制循环中胆固醇水平。目前体内实验证实主要有三个miRNAs与ApoB基因相关：miR-30c[18]、miR-34a[19]和 miR-122[20]；体内在 C57BL/6 小鼠模型中，通过慢病毒过表达miR-30c可显著降低ApoB的表达和活性，还可降低血浆胆固醇和VLDL水平；在ApoE-/-的小鼠模型中过表达miR-30c的结果与上述模型的结果一致，并且观察到可以缩减AS斑块；在LdLr-/-小鼠模型中过表达miR-34a可显著降低循环胆固醇，甘油三酯（TG）以及ApoB水平，并且可缩减AS斑块负荷；对普通饲料喂养的小鼠体内抑制miR-122，4周后的显著降低体内LDL-C、ApoB及TG水平。

PCSK9相关的miRNAs：PCSK9作为一个水解酶，在生理情况下可降解细胞膜上过多的LDLR表达，而有效抑制PCSK9的表达和活性，将提升LDLR的表达，从而达到降低循环LDL-C的目的。体外细胞实验已证实miR-224直接靶向PCSK9的mRNA，从而降低PCSK9表达[21]；而miR-195和 miR-27a均可上调 PCSK9 的表达[16，22]；miR-132 和 miR-499可间接下调PCSK9转录调节因子固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）的表达[23]。此外，来自巴西的学者预测了一些与PCSK9的mRNA3‘UTR区域结合的miRNAs[24]。可能由于PCSK9研究起步较晚，因此miRNAs与其相关的研究不多，鉴于其抑制剂在临床使用中非常有效，期待今后更多体内的研究探讨miRNAs与PCSK9的关系。

2.2 miRNAs与HDL-C

研究表明，HDL 对动脉血管壁有直接的保护作用，并能促进AS斑块的消退，因此探索与HDL-C相关的miRNAs，可为将来基因治疗提供一定的思路。ABCA1和ATP结合盒转运体G1（ABCG1）是ATP结合盒转运体超家族中的一员。ABCA1主要负责促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出，ABCG1主要负责促进胆固醇流出到成熟HDL上，两者在维持细胞内胆固醇的动态平衡中起到非常重要的作用。研究证实影响ABCA1和ABCG1的miRNAs主要有：miR-10b、miR-19b、miR-26、miR-27a/b、miR-33a/b、miR-128-1、miR-144、miR-148a、miR-302a、miR-758[25，26]。此外，B 类 I型清道夫受体（SR-B1）既介导细胞选择性摄取HDL和LDL-C，同时也可以通过与HDL的相互作用，介导胆固醇的逆转运。与SR-B1相关的miRNAs主要有：miR-96、miR-125a/b、miR-185、miR-223、miR-455[27，28]。

2.3 miRNAs与家族性高胆固醇血症的研究进展

miRNAs与FH的研究起步较晚，到目前为止直接来源于FH患者的证据的文章仅有4篇。最早的miRNAs和FH相关的研究是2011年美国马里兰大学的团队采取FH患者的血液提取HDL，检测其中的miRNAs并与正常人的进行比较后发现，表达明显上升的是miR-223、miR-105和miR-106a，随后在高脂喂养的LdLr-/-小鼠中证实了miR-223显著升高[29]；2014年上海交通大学团队发表论文显示，他们采用U133 2.0芯片对6例杂合FH患者和12例正常人进行检测，最后围绕五个主要的转录因子和相关的miRNAs绘制了交叉反应图谱，里面有很多和LDL-C代谢相关的miRNAs， 如：miR-27a/b，miR-130b，miR-185 等[30]；随 后2015年来自意大利团队为探讨miR-33a和miR-33b与FH儿童的相关性，收集了28例FH儿童和25例正常儿童进行检测，结果发现这两个miRNAs在FH儿童中显著升高，并与总胆固醇（TC）、LDL-C、ApoB及C反应蛋白正相关，揭示了miR-33a和miR-33b可作为FH儿童时期的早期生物标志物[31]；2017年西班牙团队采用含30个与血管平滑肌细胞生理和病理生理相关的miRNAs芯片，分别对心脏移植患者的动脉平滑肌细胞，血管平滑肌细胞系等进行筛选，再到FH患者中进行验证，最后发现miR-24-3p和miR-130a-3p在FH患者中明显降低，随后作者又在50例CHD患者中进行验证，发现循环中miR-130a-3p和CHD显著负相关，提示miR-130a-3p可作为FH发生CHD的早期生物标志物[32]。

图1 可能与家族性高胆固醇血症相关的miRNAs汇总图

在动物实验中，Martins等[33]采用联合miRNA沉默的三羟基三甲基戊二酰辅酶A还原酶以及转基因LDLR质粒的方法，构建pLDLR-LDLR-miR82融合质粒，采用水流动力学注射到LdLr-/-小鼠的肝脏，不仅可降低39%的LDL-C水平，还可有效延缓AS的进展，治疗12周后也无明显肝功能异常及肝脏胆固醇聚积等不良反应。

3 miRNA治疗新进展

近来，美国食品药品管理局审批了ApoB的反义寡核苷酸——米泊美生（mipomersen）用于治疗HoFH[34]；新型长效PCSK9靶向RNAi治疗性抑制剂（inclisiran， ALN-PCSsc）也完成了510例心血管疾病高危患者的Ⅱ期多中心临床试验，结果显示在第1天和第90天分别使用300 mg的剂量，48%的患者在6个月后的LDL-C水平低于50 mg/dl，并且LDL-C水平可持续降低至8个月[35]；以上研究对于FH的新型治疗提供了新思路。然而反义寡核苷酸与miRNA相关的治疗存在如下问题：（1）与内源性miRNAs的生物合成相互竞争；（2）晚期干扰素应答反应等；（3）脱靶效应[36]。而miRNAs可有效避免上述问题，因此miRNAs有望成为新的治疗手段。目前正在进行临床研究的有两个miRNAs：miR-122和miR-34。第一个药名是miravirsen，是专门抑制miR-122的锁核酸修饰的硫代反义寡核苷酸，来自加拿大的研究者在7个国际中心对miravirsen用于36例慢性丙肝感染的有效性和安全性进行了评估，随机分组后随访18周发现miravirsen用于慢性丙肝1型感染患者表现出长期剂量依赖性地减少丙肝病毒RNA水平，且未出现病毒抵抗性[37]；另一个临床试验的是MRX34——miR-34的双链miRNA模拟物，可通过抑制多个抑癌基因的通路以及刺激抗肿瘤免疫反应从而达到抑制肿瘤的作用。研究者对47例晚期实体肿瘤的患者进行每周两次的静脉注射MRX34，证实在这些患者中可安全耐受，且对于非原发性肝癌的患者来说，最大耐受剂量为110 mg/m2[38]。但是，目前把miRNAs治疗广泛用于临床还有一些问题需要解决：（1）载体问题。总所周知常规使用的慢病毒、腺病毒等病毒载体存在免疫原性，细胞毒性，甚至有促癌风险，而非病毒载体如脂质体和纳米材料等，同样存在无法细胞特异性输送的问题；（2）miRNAs的多效性。由于miRNAs存在生物学多效性，而大多数体内研究仅是针对某个特定的器官进行的观察，缺乏整体的探讨，是否除了靶基因治疗之外还存在其他的作用，值得深入探讨。综上所述，miRNAs的临床治疗已经开展，从目前的试验结果看，miRNAs具有一定的临床应用价值，然而在AS或是CHD的治疗领域，将来还需要更多的研究加以证实其有效性和安全性。

我国新近研究表明，中国FH的人群患病率为0.31%，在CHD患者中更高，达到3.9%[39，40]。因此，应一方面大力宣传FH，增加患者和医生对该病的认识程度；一方面提倡早期筛查早期治疗FH；另一方面应探寻新的FH治疗方式，以减少FH疾病所带来的巨大经济负担。随着科技快速发展，新型技术的开展把医学领域带来了一场全新的革命，而转化医学的兴起为基础医学研究指明了新的方向。随着miRNAs研究的不断深入，新技术的不断发展，我们期待新型的miRNAs治疗能成为FH患者的有效治疗药物之一，能使这些患者的LDL-C水平真正达到指南要求的目标值，从而延缓AS的进展，最终延长患者生命。