蒲公英多糖穴位离子导入对急性乳腺炎大鼠炎性因子的改善作用*

金佳佳 陈建华 季晓亮 杨伟刚

（浙江省湖州市中医院，浙江 湖州 313000）

急性乳腺炎是乳房急性感染性疾病，主要为金黄色葡萄球菌感染，本病占乳腺感染性疾病的75%，在哺乳期多发，初产妇更为多见，发病多在产后3~4周［1］。据文献报道，20%的哺乳期妇女曾患哺乳期急性乳腺炎［2］，一旦延误治疗，乳腺脓肿的发病率显著上升。乳腺脓肿治疗周期长，要经历乳腺脓肿穿刺或手术引流等有创性操作，影响乳房外观和产后哺乳，不利于身心健康。所以，如何有效地治疗急性乳腺炎已经成了一个迫在眉睫的问题。而现代多项研究表明，蒲公英对治疗急性乳腺炎效果显著［3］。为此，本实验观察蒲公英多糖穴位离子导入对急性乳腺炎大鼠的抗炎作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年SD雌性已孕大鼠100只，体质量 220～260 g，80～110 d龄，采购于浙江中医药大学动物实验中心（动物实验许可证：X1602249）。大鼠饲养于浙江中医药大学动物实验中心，屏障系统饲养室［温度（22±1） ℃，湿度 50%～70%，光照 150～200 Lx，噪音＜50 dB］，12 h明暗循环，各数据均能自动控制和显示。大鼠全部灭菌，自由采食全价营养颗粒饲料，自由饮用高压灭菌水。

1.2 仪器与设备 ABE-Ⅲ型智能通络治疗仪 （郑州爱博尔医疗设备有限公司生产）；AG204-电子分析天平，瑞士METTLER公司；AF100雪花状制冰机，美国SCOTSMAN公司，STP120脱水机、AP280-2包埋机、HM335E切片机、HMS70染色机，MICROM公司，YS100显微镜，日本NIKON公司（以上均由浙江中医药大学动物实验中心提供使用）；无菌操作台（苏州净化设备厂，SW～CJ～ZF）；CR21 型高速冷冻离心机（HITACHI生产）；动物测温仪（北京鸿鸥成运科技有限公司，型号 TH212）测温范围：-30～50 ℃，精度：±0.2 ℃，分辨率：0.1℃，标准传感器规格：Φ33 20 mm（大鼠）；导药衬垫为自制，用半径为2.1 cm的圆形8层无菌纱布制成；大鼠固定板（自制）；1 mL一次性注射器、5 mL一次性注射器、量筒、量杯、烧杯、镊子、止血钳、手术剪、眼科剪、试管、吸管、微量移液器、丝线、医用纱布胶布、棉签等。

1.3 药物与试剂 蒲公英多糖［西安千草生物技术有限公司，规格 30%（UV 紫外检测），批号：001］；阿莫西林（广州白云山天心制药股份有限公司，规格0.25g，国药准字H44024600）。金黄色葡萄球，购自浙江中医药大学动物实验中心，平板稀释计数法将浓度调整1.5×108CFU/mL；TNF-α、IL-1β 和 IL-6 血清酶免试剂盒，购于武汉谷歌生物科技有限公司；苏木精-伊红用于组织切片的染色 （HE染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，批号：G1120）［4］；蒸馏水（自制），生理盐水，10%的甲醛溶液，龙胆紫，碘伏，医用75%乙醇，医用凡士林等（上海荣柏生物技术有限公司生产）。

1.4 造模与分组 动物在温度20～25℃、相对湿度60%左右、水和标准饲料充足条件下饲养，称重后按照随机数字表法分为5组，每组20只：分别为空白对照组、模型组、蒲公英穴位离子导入高强度组、蒲公英穴位离子导入低强度组、阿莫西林组。各组雌鼠产后1～6 d后经10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，用75%的酒精对第4对乳腺区域进行消毒。除空白对照组外，其余4组80只雌鼠麻醉后固定，用小镊子轻轻夹起乳头，用带钝性针头的1 mL注射器轻轻刺破皮肤经乳头管插入，每侧注入50 μL的1.5×108CFU/mL金黄色葡萄球菌悬浊液。80只大鼠中75只大鼠感染16 h后腹部可见轻微肿大，第4对乳腺区域肿胀变硬，充血，体温升高，饮水和采食改变，竖毛、精神萎靡，蜷缩在笼子一角，活动量减少，整体观察与空白对照组有明显不同，表明模型复制成功。

1.5 实验方法 1）动物穴位定位。穴位的定位选取根据李忠仁主编的《实验针灸学》［5］，以比较解剖和骨度分寸法为依据。乳根：在胸部，第5肋间隙，前正中线旁开4寸。膻中：在胸部，横平第4肋间隙，前正中线上。2）蒲公英多糖离子导入液配制。蒲公英多糖：取蒲公英干品回流提取、离心，沉淀部分用无水乙醇脱水2次，返溶冻干，冻干品为粗多糖。取粗多糖溶于超滤水中，滤液过柱，洗脱液经8 kD膜包超滤，收集循环液，冻干为总多糖。同时收集透过液，浓缩冻干，为小分子对照品。取蒲公英多糖60 g，予1000 mL蒸馏水稀释，备用。3）动物治疗及对照处理。造模成功24 h后，高强度组大鼠取仰卧位并固定于大鼠固定板，将前胸部皮肤备皮并充分显露，将治疗仪输出线一端插入输出孔，另一端的正、负两个治疗电极板内放入已在蒲公英多糖离子液中浸湿的自制衬垫；先用75%的酒精涂擦前胸部皮肤，再将正、负电极板分别置于“乳根”及“膻中”穴上，接通电源选择电流深度为6级，强度为45 Hz进行治疗；低强度组大鼠电流强度为30 Hz，其余处理同高强度组；空白对照组与模型组大鼠于造模24 h后，自制衬垫予蒸馏水浸湿，其余处理同高强度组；阿莫西林组予阿莫西林混悬液（含药150 mg/kg灌胃）。各组大鼠分别按照以上方法进行处理，不同的电流强度大鼠均能耐受，每次20 min，每日1次，1周为1个疗程，连续治疗2周观察相应指标。期间饲料和饮用水准备充足。1.6 观察指标 1）病理观察。用颈椎脱臼方法处死大鼠，选取第4对乳腺区，以乳头为中心取直径为1 cm，深度穿透皮肤层进行取材，取致炎术后各组大鼠乳腺组织，行免疫组化试验并作病理切片，比较对照组与给药组间组织病理学变化之差异。2）血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量。根据大鼠当天体质量给予0.3 mL/100 g水合氯醛，待其麻醉后，在木板上固定，切开腹腔，暴露腹主动脉，持一次性采血针头（前针头）平刺腹主动脉，见血后将采血针尾端（后针头）插入抗凝真空负压采血管内，取血液1 mL后更换非抗凝管取血液3 mL。采血后抗凝真空负压采血管上下颠倒混合5～10次。对采血管进行标记。由我院检验科测定白细胞计数。将非抗凝采血管放置于离心机中，离心转速约为2000 r/min，离心15 min后取上清液0.8 mL，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠各指标的含量。3）乳腺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达：取各组乳腺组织一份固定于10%的甲醛溶液中48 h。经过逐级乙醇脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋，超薄切片，备用。将石蜡包埋的乳腺组织切成3 μm薄片、脱蜡、水化、蒸馏水等冲洗，经过苏木精-伊红染色后，在显微镜下观察各组乳腺组织形态学改变，包括水肿、炎性细胞浸润等情况。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，计量资料应用t检验和秩和检验评价试验结果。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组病理切片结果 见图1。空白对照组：大鼠乳腺腺泡结构完整，未看到明显的病理变化。模型组：外膜间质有淋巴细胞 ，腺泡上皮细胞脱落，有明显充血情况，空泡变性。蒲公英穴位离子导入高强度组：腺泡未脱落，治疗效果最好。阿莫西林组：轻微充血，有上皮细胞脱落；症状减轻，外膜结构清晰。蒲公英穴位离子导入低强度组：腺泡饱满，充血不明显，症状明显减轻，外膜未见淋巴细胞，正常腺泡较多，个别有脱落。

图1 各组大鼠乳腺病理组织学切片（HE染色，400倍）

2.2 各组血清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量 见表1。与空白对照组相比，模型组血清中的TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的含量显著升高 （P＜0.05）；与模型组相比，蒲公英穴位离子导入高强度组、蒲公英穴位离子导入低强度组、阿莫西林组血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均显著降低（P＜0.05）。

表1 各组血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比较（±s）

表1 各组血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比较（±s）

与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。 下同

组别 n IL-6（pg/mL）空白对照组 20 8.81±2.11模型组 20 153.44±37.15*阿莫西林组 20 127.42±28.36△TNF-α（ng/L） IL-1β（pg/mL）11.51±3.42 57.25±15.13 39.37±12.12*186.35±38.43*30.23±8.36△ 154.25±37.13△低强度组 20 85.16±19.43△21.34±7.31△ 108.36±27.21△高强度组 20 14.61±5.43△ 73.53±19.12△ 34.25±5.33△

2.3 各组乳腺组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达比较见表2。与空白组比较，模型组乳腺组织中的TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，蒲公英穴位离子导入高强度组、蒲公英穴位离子导入低强度组、阿莫西林组中乳腺组织中的TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量明显降低（P＜0.05）。

3 讨 论

急性乳腺炎多发于哺乳期，病因分感染性和非感染性两种［6］，前者多由金黄色葡萄球菌感染所致，一般有红肿热痛，或发热等全身症状，很多哺乳期女性会经历轻重程度不同的的乳腺炎，严重影响泌乳，不利于母婴身心健康［7-9］。西医一般常规采用抗生素治疗，此方法不仅影响哺乳，而且经乳汁的抗生素可进入婴儿体内，影响婴儿发育［10-11］。

表2 各组乳腺组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达比较（±s）

表2 各组乳腺组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达比较（±s）

组 别 n IL-6（pg/mL）空白对照组 20 1.00±0.13模型组 20 36.45±0.89*阿莫西林组 20 12.42±0.67△TNF-α（ng/L） IL-1β（pg/mL）1.01±0.01 1.00±0.08 4.36±0.19* 13.07±0.86*1.31±0.06△ 9.55±0.35△低强度组 20 1.42±0.81△0.51±0.05△ 2.36±0.31△高强度组 20 0.82±0.04△ 0.42±0.03△ 0.69±0.07△

其中TNF-α、IL-1β、IL-6等是目前公认的主要促炎因子，这些因子在生物损伤和SIRS的病理过程中发挥重要作用，其通过分泌量增加及各种炎症因子的瀑布式释放产生炎症反应。TNF-α在细菌等感染后直接升高，特异性高，是炎症反应的首要因素；IL-1β则是通过改变前炎症介质或抗炎症细胞因子的表达和影响组织多型核中性粒细胞聚集而促进炎症的发展，引起组织细胞损伤［12-13］；IL-6对B细胞、T细胞增殖、分化均有促进作用，同时IL-6与其受体结合活化丝氨酸/苏氨酸激酶促 CRP产生［14］，参与机体炎症反应、免疫调节等过程［15］，故 IL-1β、IL-6 对炎症反应的发生起到协同作用。

蒲公英味苦甘，性寒，无毒，入肝、胃经，具有清热解毒、消肿散结、止痛散瘀、养阴凉血、通乳益精、利尿通淋等功效［16］。现代药理研究表明，蒲公英中含有多种有效成分，如胡萝卜素类、三萜类、植物甾醇类、倍半萜内酯类、香豆素类、黄酮类等［17］。炎症是临床最为常见的病理过程之一，因此抗炎中药的研发尤为重要。蒲公英分布广泛，价格低廉，目前蒲公英外敷治疗急性乳腺炎的研究较多，且效果确切，但蒲公英提取物联合穴位离子导入这种新型的给药方式的研究甚少，且作用机制尚未明确。

本研究显示与模型组比较，蒲公英多糖穴位离子导入能明显减轻乳腺组织的病理损伤，蒲公英多糖高强度组、蒲公英多糖低强度组、阿莫西林组血清中的炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明显下降，差异具有统计学意义（P＜0．05），且乳腺组织中 TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量均显著降低，有统计学意义 （P＜0.05）。由此得出，蒲公英多糖能够有效降低急性乳腺炎大鼠的炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，抑制炎症反应，保护和修复乳腺组织细胞，且进一步证实蒲公英多糖通过高强度穴位离子导入的给药方式抗炎作用更强，穴位离子导入能够促进药物的渗透与吸收。穴位离子导入法在直流电的作用下，用直流稳压电源，使药物离子循序渐进地透过皮肤导入穴位。其优势明显，首先药物不经过肝脏“首过效应”和胃肠道破坏，降低毒副作用，可维持稳定、持久的血药浓度；其次穴位是脏腑气血汇集之处［18］，现代科学证明了人和动物的经络穴位具有较周围皮肤阻抗低、电容大等特征，且经络穴位对渗透药物的效果更佳。刘建平等［19］用氨茶碱膜剂平喘作用实验，证实穴位电阻值确实低于非穴位电阻值，且能促进药物的吸收。但穴位离子导入具体的信号通路应进一步研究和探讨。

总之，蒲公英多糖穴位离子导入法，根据中医经络理论将中药提取物、经络穴位与离子导入有机融合，既有穴位刺激作用，又有中药治疗效果，具有明显的疏通经脉、调和气血的功效［20］，在局部产生药物浓度的相对优势，发挥最大的全身药理作用。而本研究这种新型的给药方式能够抑制急性乳腺炎大鼠促炎细胞因子的产生及表达，最终发挥抗炎作用，为临床治疗急性乳腺炎提供了新的思路。