平菇漆酶对农药六六六降解作用研究*

刘绍雄，李建英，刘春丽，王明月，张微思，罗孝坤

（1．中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2．云南省供销合作社科学研究所，云南 昆明 650221；3．云南省农村科技服务中心，云南 昆明 650021）

有机氯农药是一类应用较早的高效广谱杀虫剂，被广泛用于农业、林业中，由于其具有长期残留性、生物富集性和高毒性等特征，而受到全世界的广泛关注[1－2]。六六六又名六氯环己烷（Hexachlorocyclohexane，HCH），是最为常见的有机氯农药，我国从1983年开始禁止六六六的生产和使用，但因其理化性质稳定，半衰期较长，自然降解缓慢[3－4]，长期在自然界中富集、迁移，目前水、土壤、作物、林木中仍能检出，残留风险依然存在[5]。而在食用菌的生产过程中，农林副产物是主要的原料资源，被污染的农林副产物将对食用菌造成间接污染，给食用菌产品质量安全带来了严重威胁。

食用菌漆酶是在食用菌生长发育过程中产生的1种多酚氧化酶[6-8]。有研究表明[9-10]，在食用菌菌丝生长过程中，食用菌自身对农药残留具有降解作用，使农药残留量不断减少。漆酶作为食用菌胞外酶系的重要成员，势必在其生长发育过程中和有机氯农药残留降解作用中发挥着重要作用。目前漆酶对有机氯农药六六六的降解作用及菌丝生长过程中的消解动态作用的研究鲜有报道。本文通过研究平菇漆酶对农药六六六的降解作用，以期为农药六六六残留治理、食用菌栽培安全生产等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：平菇89，由中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所菌种中心提供。

主要试剂：六六六标准品溶液（δ-六六六）、ABTS、冰乙酸、无水乙酸钠、葡萄糖等试剂均购于云南晨绿生物科技有限公司。

主要仪器：水浴锅、紫外分光光度计、离心机、恒温振荡培养箱等。

1.2 试验方法

1.2.1 平菇在液体培养基中产漆酶特性

（1）漆酶粗酶液制备

将平菇菌株接入30 mL PDA液体培养基的三角瓶中，接种块大小2 cm×0.7 cm×0.2 cm（长×宽×厚），每瓶3片～5片，于恒温振荡培养箱24℃、110 r·min-1培养12 d，每隔2 d提取1次培养液，离心后取其上清液，即为粗酶液，4℃冰箱中保存备用[11]。

（2）漆酶酶活性测定

平菇漆酶酶活性测定采用ABTS法[11]。定义每分钟使吸光值增加0.1所需的酶量为1个酶活力单位（U）[12-13]。

1.2.2 漆酶对有机氯农药的降解作用

设置对照CK（不加粗酶液）、加酶量1（加酶量为1.5 U·mL-1）、加酶量2（加酶量为3 U·mL-1）、加酶量3（加酶量为4.5 U·mL-1）和加酶量4（加酶量为6 U·mL-1）共5个处理，分别加入农药六六六溶液（浓度为5 μg·L-1），采用GB/T 5009.19[14]方法，测定农药六六六残留量。

1.2.3 漆酶酶活性与农药六六六残留变化规律

灭菌后在培养基中添加农药六六六（浓度为10 μg·L-1），以不添加农药六六六为对照（CK），将平菇菌株接种于培养基中，于恒温振荡培养箱24℃、110 r·min-1培养，每隔2 d取1次培养液，测定培养液漆酶酶活性和农药六六六残留量。

1.2.4 农药六六六在菌丝生长过程中的消解动态

灭菌前后分别在培养基中添加有农药六六六（浓度为10 μg·L-1），测定高温高压灭菌对农药降解的影响。灭菌后在培养基中添加有农药六六六（浓度为10 μg·L-1），将平菇菌株接种于培养基中，于恒温振荡培养箱24℃、110 r·min-1培养20 d，每隔4 d取1次培养液，测定培养液中农药六六六残留量。

2 结果与分析

2.1 平菇产漆酶规律变化研究

平菇菌株在液体培养基中漆酶酶活性变化结果见图1。

图1 平菇菌株在液体培养基中漆酶活性Fig.1 Laccase activity of Pleurotus ostreatus in liquid medium

由图1可以看出，平菇菌株在液体培养基生长过程中，漆酶酶活性随着培养时间的增加漆酶酶活性逐渐增强，第6天时漆酶酶活性增长开始放缓，8 d达到峰值，为4.79 U·mL-1，随后随着培养时间延长，酶活性逐渐降低。

2.2 平菇漆酶对有机氯农药的降解作用研究

不同浓度漆酶液对农药六六六的降解作用结果见图2。

由图2可以看出，随着漆酶浓度的增加，农药六六六残留减少，且呈负相关关系，相关性系数R值为0.993，这说明平菇漆酶对有机氯农药六六六具有降解作用。

2.3 平菇漆酶活性与农药六六六残留变化规律研究

平菇漆酶酶活性与农药六六六残留变化规律研究结果见图3。

从图3可以看出，在添加农药后，农药对平菇漆酶酶活性影响较大，漆酶酶活性整体偏低，最大酶活为8.26 U·mL-1。而不加农药时，漆酶酶活达到峰值时，酶活为20.06 U·mL-1。从农药残留量变化和漆酶酶活性变化来看，随着平菇漆酶酶活性的逐渐增强，有机氯农药六六六残留量逐渐减少，培养到2 d～6 d时，菌丝活力最强，菌丝生长速度最快，有机氯农药六六六残留下降得最快。

图2 平菇漆酶对农药六六六的降解作用Fig.2 Degradation of HCH by laccase of Pleurotus ostreatus

图3 平菇漆酶变化与农药六六六残留变化规律Fig.3 Regularity of the changes of laccase of Pleurotus ostreatus and HCH residue

2.4 农药六六六在菌丝生长过程中的消解动态

高温灭菌对农药六六六降解情况的影响和农药六六六在菌丝生长过程中的消解动态变化，见表1和图4。

表1 高温灭菌对农药六六六降解情况影响Tab.1 Effect of high temperature sterilization on the degradation of HCH

图4 农药六六六在菌丝生长过程中的消解动态Fig.4 Degradation dynamics of HCH during the growth of mycelium

由表1可以看出，培养基中的农药六六六通过高温高压灭菌后未检出，几乎完全降解。从图4可以看出，在菌丝生长过程中，农药六六六残留量随着菌丝培养时间延长而逐渐降解，降解方程为y=6.3993e-0.099x（R2=0.9728）。通过方程可计算出农药六六六在液体培养基菌丝生长过程中，半衰期为7.0 d。

3 结论与讨论

平菇菌株在液体培养基中，漆酶酶活性随着培养时间的增加先逐渐增强，8 d达到峰值，随后逐渐降低。漆酶参与了菌丝体的营养物质的利用，平菇菌株在液体培养基中生物量逐渐达到最大。然后随着培养基中营养成分的减少，菌丝活力开始减弱，菌丝生长速度开始下降，表明漆酶酶活性在一定程度反映了菌丝的活力，这与黎志银[10]、张权等[15]相关研究相似。

平菇漆酶对有机氯农药六六六具有降解作用，漆酶酶活性与农药降解呈正相关关系。在菌丝生长过程中，随着平菇漆酶酶活性的逐渐增加，有机氯农药六六六残留量逐渐减少，说明平菇菌株在生长过程中可以通过自身产生的漆酶对培养基中的有机氯农药六六六进行分解。

农药六六六在菌丝生长过程中，残留量随着菌丝培养而逐渐减少，半衰期为7.0 d，对平菇漆酶影响较大，会降低了培养基中漆酶酶活性。平菇在PDA液体培养基中菌丝生长时间为5 d～7 d，甚至更短，在培养过程中，农药残留抑制了菌丝的生长，从而影响漆酶酶活性。

高温灭菌后农药六六六几乎完全降解，在农药六六六污染较严重的地区，食用菌采用高温灭菌的熟料栽培方式更为安全。