高压超临界CO2提取灵芝三萜和甾醇成分的研究

华正根 ，王金亮 ，2，朱丽萍 ，吴长辉 ，2，姚渭溪 ，2，李 晔 *

（1．福建仙芝楼生物科技有限公司，福建 福州 350002；2．国家食用菌加工技术研发分中心，福建 福州 350002）

灵芝（Ganoderma lucidum） 又称瑞草、仙草，性平味甘，为我国名贵的传统中药材，一直被中华传统医学视为滋补强身、固本扶正的珍贵中草药。

灵芝的成分丰富，包括灵芝多糖、三萜及甾醇成分、核苷、蛋白质和微量元素等，其中灵芝三萜和甾醇成分以及灵芝多糖是最主要的活性物质，近年来一直是研究的重点。现代医药学研究灵芝及其提取物发现，灵芝三萜类化合物具有抗肿瘤、保肝，降低血糖，抑制血管紧张素、抗氧化等功效[1]；灵芝多糖具有抗肿瘤、衰老，提高免疫力，清除自由基，降低血糖等功效[2]；灵芝甾醇具有增强人体抵抗疾病的能力，降低血液中的胆固醇浓度，预防前列腺疾病等功效[3]。这些成分各起作用，且成分之间又有协同作用。

目前，对灵芝中的灵芝多糖、三萜成分研究较多[4－5]，对灵芝甾醇类化合物的研究相对较少。在传统的提取工艺中，提取灵芝中三萜及甾醇类化合物的方法通常有乙醇回流提取法、有机溶剂提取法、微乳提取法，为了能够更加有效地提高溶剂的提取效率，需要新技术的辅助，如超声波、微波等辅助提取[6]。

超临界CO2提取技术，自20世纪60年代在咖啡豆内脱除咖啡因、提取啤酒花浸膏等方面实现产业化后，在食品香料、化工材料、中医中药和环境保护等领域获得广泛应用。由于高压密封及其安全等方面的限制，目前超临界CO2提取的产业化设备的提取压力大多在35 MPa。鉴于CO2的非极性特性，提取脂溶性成分主要采用35 MPa的超临界CO2提取压力，若提取低极性成分，通常需要在CO2中添加少量的极性溶剂（例如乙醇）作为夹带剂，但是，如果想要除去进入提取物中的极性溶剂，也会带来许多新问题。随着技术进步，当前许多超临界CO2产业化设备能达到50 MPa，与提取压力35 MPa设备相比，压力的提高使超临界CO2的密度增大，提高了提取能力，而且不添加夹带剂，除了能提取脂溶性成分外，还能提取部分低极性成分。在有关单位协助下，使用105 MPa的高压超临界CO2设备采用梯度高压对提取的灵芝成分进行了初探，试验表明提高超临界CO2设备的提取压力，能够增加超临界CO2介质的密度和溶解能力，能从灵芝细粉中提取出更多的灵芝三萜和甾醇成分，将为灵芝提取提供新方法。

1 材料与方法

1.1 试剂

甲醇、乙腈为色谱纯；水为实验室自制超纯水；灵芝细粉（40目～60目），福建仙芝楼生物科技有限公司自制；灵芝酸A、B、C1标准品，中国药品生物制品检定所；麦角甾醇，福建省食品药品检定研究院。

1.2 仪器

LC－20AD液相色谱仪，日本岛津公司；KQ－100E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；A1140型万分之一电子分析天平，美国奥豪斯仪器有限公司；DK－S28电热恒温水浴锅，上海精科实业有限公司；超临界提取装置，德国伍德超临界设备有限公司。

1.3 方法

1．3．1 超临界CO2提取灵芝三萜及甾醇的研究

（1）超临界工艺流程

超临界工艺流程图如图1所示。

图1 超临界工艺流程图Fig．1 Flow chart of supercritical process

（2） 高压超临界CO2提取试验

按照超临界CO2提取的工艺流程图所示，将灵芝细粉1 kg装入提取釜，按设定的温度和CO2流量进行高压提取，考察不同提取压力（30 MPa、65MPa、85 MPa、105 MPa） 条件下的提取情况，从分离釜中收集提取物，于65℃进行干燥。称取提取物0．10 g，加入乙醇20 mL，超声处理45 min，定容，离心（转速 4 000 r·min－1，离心 10 min） 得上清液，高效液相色谱测定灵芝三萜和甾醇的含量，计算灵芝三萜和甾醇的提取含量。灵芝中三萜和甾醇含量（N，%） 公式为：

式中：m1表示灵芝三萜和甾醇的质量，g；m2表示灵芝细粉的质量，g。

1．3．2 传统乙醇回流提取试验

称取灵芝细粉，加入95%乙醇溶剂进行回流提取，提取工艺参数[7]：料液比1:10，提取温度80℃，提取时间1．5 h，提取3次。

1．3．3 提取物样品HPLC分析

（1）样品溶液的制备

分别称取乙醇回流提取法提取的醇提取物和高压超临界CO2提取法的提取物0．1 g，加甲醇，超声溶解，4 000 r·min－1，离心 10 min，取上清液，0．45 μm滤膜滤过，上C18色柱谱。

（2）对照品溶液的制备

分别精密称取5．0 mg的灵芝酸B、A、C1共3种灵芝酸标准品和麦角甾醇标准样品，加入甲醇5．0 mL，分别配成 1．0 mg·mL－1的对照品溶液。

（3）灵芝三萜酸的高效液相色谱法测定

色谱条件：安捷伦 Eclipse XDB－C18柱 （4．6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈 （A） －甲醇（B） －0．4%甲酸水溶液（C），梯度洗脱程序为0时，A：20%，B：20%，C：60%；30 min时，A：30%，B：20%，C：50%；35 min时，A：38%，B：20%，C：42%；40 min时，A：20%，B：20%，C：60%；45 min时，A：20%，B：20%，C：60%；流速：1．0 mL·min－1，检测波长：254 nm，柱温：30℃，进样量：10 μL。

按峰面积归一化方法，将10 min～25 min所有峰的峰面积总和，以标准品灵芝酸B的质量和峰面积计算出这个范围内总灵芝酸含量；25 min～29 min所有峰的峰面积总和，以标准品芝酸A的质量和峰面积计算出这个范围内总灵芝酸含量；29 min～40 min所有峰的峰面积总和，以标准品芝酸C1的质量和峰面积计算出这个范围内总灵芝酸含量，将这三个时间段计算出的灵芝酸含量相加即为灵芝三萜含量。

（4） 麦角甾醇的高效液相色谱法测定

色谱条件：安捷伦 Eclipse XDB－C18柱 （4．6 mm×250 mm，5 μm），流动相：甲醇 （A） －0．5%乙酸水溶液（B），梯度洗脱程序为0～45 min时，A：60%→100%；45 min～70 min时，A：100%～100%，流速：1．0 mL·min－1，检测波长：282 nm，柱温：35℃，进样量：10 μL。

（5）灵芝三萜和甾醇成分的高效液相色谱图对照

色谱条件：色谱柱，安捷伦Eclipse XDB－C18柱 （4．6 mm×250 mm，5 μm），流动相：甲醇 （A） －0．5%醋酸水（B），梯度洗脱程序为0～30 min时，A：50%→80%；30 min～35 min时，A：80%→85%；35 min～65 min时，A：85%→85%；65 min～70 min时，A：85%→95%；70 min～80 min时，A：95%→95%；80 min～85 min时，A：95%→100%；85 min～110 min 时，A：100%→50%，流速：1．0 mL·min－1，进样量：10 μL，柱温：30℃，检测波长254 nm。

2 结果与分析

2.1 高压超临界CO2提取试验内容和结果

设定提取温度为50℃，提取时间为4．0 h，分离压力为10 MPa，分离温度为40℃，CO2流量为12 L·h－1，收集提取压力分别为 30 MPa、65 MPa、85 MPa、105 MPa条件下的提取物，观察灵芝三萜和甾醇成分含量的变化，结果见图2。

图2 提取压力对灵芝三萜和麦角甾醇含量的影响Fig．2 Effect of extraction pressure on the content of triterpene and ergosterol in Ganoderma lucidum

提取压力影响CO2的密度，是影响CO2溶解能力的重要因素。由图2中可以看出，灵芝三萜和麦角甾醇含量随着提取压力的升高而增大，当提取压力为85 MPa时，灵芝三萜含量为1．34%，麦角甾醇的含量达到0．32%，继续升高压力，超临界CO2提取法的提取效率也随之提高，但提取效率提高较少，并且提取压力过高，会增加设备的损耗和成本。综上所述，确定最佳提取压力为85 MPa。其优化的工艺条件为：提取压力85 MPa，提取温度50℃，提取时间4 h，在此条件下，灵芝三萜含量为1．35%，麦角甾醇含量为0．32%。

2.2 高压超临界CO2提取法与乙醇回流提取法比较

灵芝三萜和甾醇成分的提取方法较多，但是普遍采用的是乙醇回流提取法。本试验采用同一批次的灵芝细粉原料分别进行高压超临界提取法和乙醇回流提取法比较。

2．2．1 灵芝三萜成分比较

以灵芝酸B、A、C1作为标准品。结果见图3、表1。

由图3可以看出，在相同的样品进样浓度和体积条件下，高压超临界CO2提取法的提取物与乙醇回流提取法的提取物有同样的峰形，可见2种方法都能将灵芝三萜成分提取出来，三萜含量高低不同。

表1结果表明，与乙醇回流提取法相比，高压超临界CO2提取法提取温度较低，灵芝三萜和麦角甾醇含量分别比乙醇回流提取法高了46.7%、60%，而提取时间较乙醇回流提取法短。可见高压超临界CO2提取法具有耗时短、提取率高、效益高等优点。

图3 高压超临界CO2提取法与乙醇回流提取法提取灵芝三萜的高效液相色谱图Fig.3 High performance liquid chromatography(HPLC)of Ganoderma lucidum triterpene extracted by high pressure supercritical CO2extraction and ethanol reflux extraction

表1 高压超临界CO2提取方法与乙醇回流提取方法比较Tab.1 Comparison of high pressure supercritical CO2extraction and ethanol reflux extraction

2.2.2 甾醇成分的比较

以麦角甾醇作为标准品进行比较，结果见图4、表1。

由图4可以看出，在相同的样品进样浓度和体积条件下，在出峰时间56 min时，高压超临界CO2提取法的提取物与乙醇回流提取法的提取物有同样麦角甾醇的峰，但前者麦角甾醉的含量比后者高。

2.2.3 高压超临界CO2提取法与乙醇回流提取法的HPLC图谱比较

高压超临界CO2提取法与乙醇回流提取法的HPLC图谱的比较结果见图5。

由图5可以看出，在相同的样品进样浓度和体积条件下，在20 min～40 min高压超临界CO2提取法的提取物的出峰个数比乙醇回流提取法的提取物多，而在其他出峰时间2种提取物的出峰数量、保留时间基本保持相同，色谱峰峰形也极其相似，这说明高压超临界CO2提取法提取出的三萜和甾醇成分的种类比乙醇回流提取法多。

图4 高压超临界CO2提取法与乙醇回流提取法提取的麦角甾醇的高效相色谱图Fig.4 High performance liquid chromatography(HPLC)of ergosterol extracted by high pressure supercritical CO2extraction and ethanol reflux extraction

图5 高压超临界CO2提取和乙醇回流提取样品的HPLC谱图Fig.5 HPLC spectra of samples extracted by high pressure supercritical CO2extraction and ethanol reflux extraction

3 讨论

超临界CO2提取技术作为1种提取新工艺，因其提取时间短，无污染，产品品质好，同时有效地避免了传统提取工艺对天然成分尤其是对热敏性物质的影响而倍受青睐，具有广阔的发展前景。本试验以灵芝三萜和甾醇成分含量为考察指标，通过不同提取压力试验对超临界CO2高压提取工艺条件进行筛选，确定提取工艺条件为：提取压力85 MPa，提取温度50℃，提取时间4 h，CO2流量为12 L·h-1。试验表明，随着提取压力的提高，超临界CO2提取法的提取效率也随之提高，但到达85 MPa时会趋于平衡，因此提取压力不是越高越好。

由于灵芝三萜和甾醇成分难溶于水，易溶于乙醇、甲醇、氯仿等有机溶剂[8]，但因甲醇、氯仿毒性比乙醇大，且乙醇提取法是传统的提取方法，故该试验选择将乙醇回流提取法和超临界CO2提取法进行比较。结果表明，与乙醇回流提取法相比，高压超临界CO2提取法提取温度较低，灵芝三萜和甾醇成分含量分别比乙醇回流提取法高出46.7%、60%，而提取时间较乙醇回流提取法短。可见超高压CO2提取法具有提取率高、耗时短、效益高等优点。HPLC图谱表明，高压超临界CO2提取法的提取物中三萜和甾醇成分种类较多。灵芝子实体主要成分由纤维素、半纤维素和木质素构成，纤维化结构高达80%以上，结构致密，具有较好的维持力，而灵芝成分附着于细胞壁、细胞内，较难渗出，在提取过程中，高压力破坏了灵芝细胞表面的结构，使细胞内外的压力差增大，超临界CO2就能轻易地进入灵芝细胞内，灵芝中三萜和甾醇等成分被高效地提取出来。

高压超临界CO2提取法，由于对设备要求高、费用高、容积小等问题，目前该法尚处在研究探索的阶段，但其对于其他物料的提取具有一定的参考价值。