白术内酯Ⅲ对痴呆大鼠学习记忆能力及海马Bcl-2表达的影响

于新宇，张媛媛，嵇志红

(大连大学医学院，辽宁 大连 116622)

老年痴呆又称阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)，是一种中枢神经系统的进行性退变疾病，多发于65岁以上的老年人，是老年人群痴呆的主要原因.AD的临床表现主要为进行性记忆、认知功能障碍及行为失常，典型的病理学表现为β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积、神经元纤维缠结、神经元丢失及突触丢失等.抗AD药物的开发研究已成为当今神经科学研究领域中的一个重要课题.中药白术为菊科植物白术(Atractylodismacrocephala)的根茎，为脾经之药，具有健脾益气、止汗、安胎等功效[1].近年来，白术的神经保护作用越来越受到人们关注[2-5]，但白术内酯Ⅲ(Atractylenolide Ⅲ，ATLⅢ)对老年痴呆动物记忆减退的改善作用尚未见报道.本实验采用行为测试、生化测定及免疫印迹杂交技术结合的方法，考查了ATLⅢ对老年痴呆大鼠记忆障碍的改善作用，初步探讨了其作用机制，以为白术在临床的药理应用提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 动物

实验选用健康成年雄性SD大鼠50只，体重(270±20) g，购于大连医科大学SPF实验动物中心.整个实验过程中大鼠自由饮食饮水，于室温20℃～22℃、12 h光照12 h黑暗条件下饲养.

1.2 仪器及试剂

Morris水迷宫(DMS-2型，中国医学科学院药物研究所)；脑立体定位仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)；7230分光光度计(上海分析仪器厂).白术内酯Ⅲ(ATLⅢ，上海纯优生物科技有限公司，批号：16032203)；乙酰胆碱酯酶(AChE)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20160713)；β-淀粉样蛋白(Aβ1-42，美国Sigma公司，使用前用灭菌蒸馏水稀释成10 μg/μL，37℃恒温箱孵育5 d使其成为寡聚态的Aβ1-42)[6]；Bcl-2一抗(美国Cell Signaling公司)；小鼠抗β-actin、HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物公司)；ECLTM试剂(碧云天生物技术研究所)；其他试剂为国产分析纯.

1.3 动物分组与给药

大鼠适应环境2 d后随机分成5组：对照组，模型组，ATLⅢ低、中、高剂量处理组，每组10只.除对照组外，其他4组大鼠双侧侧脑室注射Aβ1-42建立老年痴呆动物模型；同时模型组灌胃生理盐水0.5 mL/d，ATL处理组分别灌胃ATLⅢ(0.5，1，2 mg/(kg·d)).对照组双侧侧脑室注射同体积生理盐水，同时每天灌胃生理盐水0.5 mL/d.连续给药4周，至行为学实验结束.

1.4 老年痴呆动物模型建立

大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5 mL/kg，麻醉后固定于脑立体定位仪上，去毛、消毒，分离骨膜暴露头骨.根据Pasinos和Watsonde的大鼠脑定位图谱，于双侧侧脑室(前囟后1.08 mm，旁开2.5 mm，硬膜下3.7 mm)注入Aβ1-4210 μg(1 μL)，留针5 min.各组动物术后消毒缝合切口皮肤.

1.5 Morris水迷宫实验

给药后24～28 d进行水迷宫实验，共历时5 d.前4 d进行定位航行试验：隐蔽平台置于东北象限水面下1 cm，每天训练大鼠4次，每次120 s；仪器自动记录从入水到找到隐蔽平台并立于其上所需时间(逃避潜伏期)，数据取4次均值.第5天进行空间探索试验：撤去平台，然后在西南象限(原平台对侧象限)入水点将大鼠面向池壁放入水中，测定大鼠120 s内在4个象限的游泳时间，其中东北象限的时间为记忆保持时间，用来判断动物记忆储存及提取再现能力.

1.6 AChE活性测定

水迷宫实验结束后，将大鼠断头取脑、冰上迅速分离海马，按质量体积比1∶9加生理盐水制成10%海马匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清按试剂盒说明测定海马AChE活性.

1.7 Western Blot检测

将海马称重后置于脑蛋白裂解液中，冰上匀浆，4℃冷冻离心机离心(10 000 r/min)10 min.取上清进行蛋白定量，蛋白样品上样，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜转移印迹，硝酸纤维素膜经5%脱脂奶粉封闭1 h，加入Bcl-2一抗室温过夜孵育，PBST洗膜3次，加二抗，PBST洗膜3次，ECL溶液显色，曝光、显影、定影.扫描仪和凝胶成像系统记录条带的光密度值.以β-actin条带光密度值作为内参，计算各目标蛋白的相对水平(目标蛋白条带光密度值/相应β-actin条带光密度值).

1.8 统计学处理

2 实验结果

2.1 ATLⅢ对痴呆大鼠学习记忆能力的影响

水迷宫实验结果(见表1)表明，在定位航行实验中，随着训练天数的增加，各组逃避潜伏期均呈缩短趋势，但第3、第4天模型组的逃避潜伏期显著长于对照组(P<0.01)，而ATLⅢ中、高剂量组的逃避潜伏期显著短于模型组(P<0.01).空间探索试验中(见图1)，模型组大鼠在原平台象限(东北象限)的停留时间显著短于对照组(P<0.01)，且与在其他象限的停留时间差异不显著，而中、高剂量ATLⅢ组在东北象限的停留时间显著长于模型组(P<0.05，P<0.01).

表1 大鼠在水迷宫中寻找隐匿平台的潜伏期 s

注：与对照组比，**P<0.01；与模型组比，##P<0.01.

2.2 ATLⅢ对海马AChE活性的影响

大鼠海马AChE活性的测定结果见表2.由表2可见：与对照组比，模型组海马AChE活性显著升高(P<0.05)；与模型组比，ATLⅢ中、高剂量组海马AChE活性显著降低(P<0.05).

表2 ATLⅢ对海马AChE活性的影响

2.3 ATLⅢ对海马Bcl-2基因表达的影响

Western Blot实验结果(见图2)表明：与对照组比，模型组海马Bcl-2的表达显著降低(P<0.01)；与模型组比，ATLⅢ中、高剂量组海马Bcl-2的表达显著增加(P<0.05，P<0.01).

与对照组比，**P<0.01；与模型组比，#P<0.05，##P<0.01.

3 讨论

目前，关于AD的发病机制尚不十分清楚，主要涉及Aβ神经毒性作用、胆碱能功能障碍、Tau蛋白异常磷酸化以及氧化应激损伤等假说.其中Aβ和AChE在AD发病机制中起着重要作用.Aβ的神经毒性已被确认为AD等神经退行性疾病的早期原因，有资料表明大鼠侧脑室注射Aβ可诱导海马ROS显著增多及海马CA1区神经元损伤，从而导致动物学习记忆能力减退[7].

乙酰胆碱(ACh)在中枢神经系统分布广泛，脑内尤其是海马内ACh含量增加可使动物学习记忆能力增强，反之可使学习记忆能力减退.由于ACh可被AChE水解失活，因而AChE活力高低可作为反映ACh含量亦即学习记忆能力的指标.研究表明，沉积的Aβ对胆碱能神经元有毒性作用，可使沉积周围的胆碱能神经元数量减少，由此导致记忆损伤[8].Aβ与AChE二者之间也有相互作用，Aβ聚集能使AChE活性升高，AChE活性升高又进一步促使Aβ聚集，AChE-Aβ复合物比单纯Aβ聚集物的毒性更大，对细胞的毒害作用更强，促使AD疾病的产生与恶化[9].也有研究指出侧脑室注射Aβ1-42可明显升高海马组织AChE活性[10]，增强大脑胆碱能功能的药物可以改善Aβ沉积引起的学习记忆障碍[11].本实验中，双侧侧脑室注射Aβ1-42可使大鼠学习记忆能力明显减退，海马AChE活性显著升高，应用ATLⅢ后海马AChE活性显著降低，结果与相关文献的报道一致.

AD导致的脑损伤涉及神经细胞凋亡.Bcl-2基因是凋亡相关蛋白中最重要的凋亡抑制因子，它对正常细胞的功能和代谢几乎无影响，但有抑制病理性细胞凋亡的作用.其抑制凋亡的机制主要是通过抑制线粒体细胞色素C的释放而抑制促凋亡关键酶caspases-3的表达，也可通过抑制细胞膜上脂质过氧化物的形成而阻止氧化应激.脑组织Bcl-2基因表达增加可一定程度增强学习记忆能力.本实验ATLⅢ组大鼠海马Bcl-2基因表达显著增加，说明其增强学习记忆能力与上调Bcl-2表达有关.

近年关于白术神经保护作用的研究逐渐增多.我们前期的实验结果表明，白术醇提取物可显著抑制兴奋毒性诱导的神经元凋亡[12]，双白术内酯可显著改善衰老小鼠的记忆障碍[13].本实验主要研究了白术的有效成分之一ATLⅢ对AD大鼠学习能力的影响，结果表明ATLⅢ可显著改善AD大鼠的学习记忆能力，其机制可能与抑制海马AChE活力、上调海马Bcl-2基因的表达有关.结果提示ATLⅢ对AD所致的认知障碍具有潜在的治疗作用.