四种污染源气体颗粒物对大鼠血清肌红蛋白和脑钠肽的影响*

齐铁雄 石琳 郑彤 包敏 刘世华 刘艳

(1.首都儿科研究所附属儿童医院心血管内科，北京 100020；2.航空总医院肾内科，北京 100012)

可吸入颗粒物可造成人类的心血管损伤，导致心脏功能降低，引起心血管疾病的发生率和死亡率增加,检测心肌损害有多项生化指标，肌红蛋白(myoglobin,Mb)在哺乳动物心肌中含量最高，且被普遍认为是影响心肌功能的重要的生化指标，是心肌损伤中最早升高的标志物之一，具有高度敏感性。脑钠肽(BNP)是1988年从猪脑中分离出来，主要由心室肌合成并分泌,其合成受到左心室室壁张力和多种神经激素作用的调节,以脉冲方式由冠状窦释放入血,主要由肾脏清除[1]。BNP主要作用是抑制交感神经的过度反应，参与血压、血容量及盐平衡的调节，从而对调节体液和血压起到重要作用[2]，被认为是一种有意义的心脏病学标志物[3]，Tsutamoto等[4]发现，脑钠肽是最好的评价心力衰竭预后的神经激素标志物。但仅根据单一标志物诊断效果不佳，需联合应用Mb和BNP可结合它们不同的诊断优势，提高诊断效能，对心脏疾病的诊断具有至关重要的意义[5]。

1 资料与方法

1.1 实验动物及设备 选用70只清洁级雄性成年SD大鼠；体质量(150±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。室温22～28℃下饲养，湿度50%～60%，自然光照周期，实验过程均饲养于标准动物房，适应性饲养2周。采用KL1-e411型全自动化学发光仪(北京中西远大科技有限公司)，RaytoRT-6100酶标仪(深圳雷杜生命科学有限公司)，Mb及BNP试剂盒购于南京建成生物工程公司。Cell Counting Kit-8 (CCK-8 试剂盒，碧云天)。

1.2 方法

1.2.1 毒物样品搜集、提取及大鼠呼吸道滴定液的制备 本实验使用的滤膜为whatman特氟龙有机滤膜及Air Metric公司生产的便携式小流量颗粒物采样器进行采样。

1.2.2 烟雾箱实验操作 采用小型室外光化学烟雾箱。箱内气体由特氟龙管，从箱子一侧的出气口接出，连接采样器进行膜采样。采用开放式燃烧室。燃烧室为长方体铁质结构，长5m，宽3m，高2m，底部有一铁托盘，秸秆及煤在铁托盘上燃烧。燃烧室上部与排烟管道相连，管道末端有一排气扇，烟气在排气扇的作用下抽出。在烟道管前方有一三通，烟气通过此三通进入箱体。实验开始时，打开三通末端烟气进气泵，分别鼓入汽车尾气、煤烟、燃烧秸秆、自然空气四种污染源气体。当烟雾箱内颗粒物浓度达到300 ug/m3并稳定时，停止鼓入烟气，关闭箱体，颗粒物采样器开始通过滤膜采集样品。称重后加水超声溶解，配成1mg/ml浓度的颗粒物悬液待滴定。

1.2.3 实验分组 将70只雄性成年SD大鼠随机分为对照组10只、汽车尾气组15只、煤烟组15只、燃烧秸秆组15只和自然空气组15只。实验组按1mg/ml的相同的浓度气管内分别滴注汽车尾气、煤烟、燃烧秸秆、自然空气颗粒的悬液每天1次，一次0.1ml，连滴10天；按0、2、4、6、8和10天6个时间点取大鼠眶静脉血清。在达到观察终点后处死全部大鼠，称体重(bodymass,BM)后，无菌进行解剖摘取心脏，称心脏质量(heartmass,HM)，肉眼观察心脏表观情况；计算HM/BM;将心脏组织左室用于病理学检测(10%中性福尔马林溶液固定)，石蜡包埋、切片，HE染色。病理分析光镜下进行观察并拍照。镜下观察各组大鼠心肌组织炎性细胞浸润、心肌组织损伤、坏死、心肌纤维化等病理改变情况。采用CCK-8法检测大鼠心肌细胞的存活率。细胞计数将含2×103个细胞/孔(约100接种于96孔板，将培养板放在培养箱中预培养，向每个细胞培养孔内加入10mlCCK8溶液，避光孵育14小时，以酶标仪测量波长450nm处吸光度值。每组设置3个复孔，实验重复5次。

1.3 观察指标 每天观察记录大鼠的饮食及体重、活动力、粪便情况，观察毛发、神经系统、循环系统和呼吸系统等情况，按6个时间点观察并记录大鼠一般情况及生存情况，记录各时间点大鼠生存数。取大鼠眶静脉血清，采用化学发光法分别检测5组的心损标志物肌红蛋白(Mb)和脑钠肽(BNP)水平的变化。

2 结果

2.1 各组实验开始后6个时间点肌红蛋白(Mb)水平变化 汽车尾气组、煤烟组和自然空气组肌红蛋白(Mb)水平滴入毒物2d后开始升高, 高于其它各组(P<0.05)，三组间无显著性差异(P>0.05)；滴入毒物的4d达到峰值,发病的8d逐渐恢复至正常值。燃烧秸秆组肌红蛋白(Mb)水平滴入毒物4d后开始升高, 高于对照组，有显著性差异(P<0.05)；滴入毒物的6d达到峰值,发病的10d逐渐恢复至正常值，见表1。

表1 各实验组肌红蛋白(U/L)水平的动态变化Table 1 The dynamic changes of myoglobin in each experimental group

2.2 各实验组6个时间点脑钠肽水平变化 汽车尾气组、煤烟组和自然空气组脑钠肽 (BNP)水平在滴入毒物4d后开始升高, 高于其它各组(P<0.05)，三组间无显著性差异(P>0.05)；滴入毒物的6d达到峰值,滴入的10d逐渐恢复至正常值。燃烧秸秆组脑钠肽 (BNP)水平滴入毒物4d后开始升高, 高于对照组，有显著性差异(P<0.05)；滴入毒物的6d达到峰值,在其发病的10d逐渐恢复至正常值，见表2。

表2 各实验组脑钠肽(BNP)(pg/ml)水平的动态变化Table 2 Dynamic changes of brain natriuretic peptide levels in each experimental group

2.3 各实验组HM/BM和心肌细胞存活率比较 汽车尾气组HM/BM明显升高(P<0.05)，有10例心肌病理出现了轻度的心肌细胞浸润、水肿、变性。5例出现了严重的心肌细胞变性、坏死、纤维化；煤烟组HM/BM明显升高(P<0.05)，有9例心肌病理出现了轻度的心肌细胞浸润、水肿、变性。6例出现了严重的心肌细胞变性、坏死、纤维化；自然空气组HM/BM明显升高(P<0.05)，有9例心肌病理出现了轻度的心肌细胞浸润、水肿、变性；6例出现了严重的心肌细胞变性、坏死、纤维化；三组心肌细胞存活率明显降低(P<0.05)，均低于秸秆组和对照组；但三组间无显著性差别(P>0.05)；秸秆组大鼠HM/BM变化不明显(P>0.05)，心肌病理出现了轻度的心肌细胞水肿、变性，HM/BM无明显升高(P<0.05)，心肌细胞存活率下降不明显(P>0.05)，见表3。

表3 各实验组HM/BM和心肌细胞存活率Table 3 HM/BM and cardiomyocyte survival rate in each experimental grou

3 讨论

实验中，我们选择了血清肌红蛋白(Mb)和脑钠肽 (BNP)作为判断大鼠心肌损害检验指标。肌红蛋白(Mb)存在于哺乳动物Ⅰ型、Ⅱa型骨骼肌或心肌组织细胞质中，是一种重要的细胞内色素蛋白。有研究表明[6]，Mb能够促进组织内的氧供应，具有氧转运载体、细胞内催化剂和氧储存等功能，在参与心肌和骨骼肌细胞的氧供应和氧消耗中发挥重要作用[7]，在心肌损伤的早期释放入血。Mb在血中出现早与其分子量很小有关，能迅速自损伤部位释放进入血液循环，从而使血清中肌红蛋白的水平明显升高。有实验表明，缺氧环境下的MbKO小鼠心脏功能障碍是有NO介导的，从而间接证明Mb具有细胞内NO水平调控作用[8]。脑钠肽(BNP)是生理和病理状况下维持心肾系统稳态的重要物质。可与其受体结合，刺激鸟苷酸环化酶而抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统的缩血管作用，抑制交感神经的过度反应，降低血浆肾素和醛固酮的浓度，促进血管的松弛，在容量负荷过多的时候产生利钠、利尿、血管扩张、血压下降的效应[9-11]，当心室负荷改变和心肌受牵张及心肌受到损伤时，BNP合成和分泌增加，并大量释放进入血液[12]。有研究认为，轻度牵拉心室即可使BNP的mRNA表达增高，合成增多，当出现心功能不全时，心室脑钠肽mRNA快速转录，突发性合成BNP，表明BNP可以作为左室功能障碍敏感性和特异性的指标[13-14]，且BNP释放与心室扩张和压力负荷成正比[15-16]。BNP也是缺血标志物，即使没有心肌坏死的情况下，心肌缺血也能使BNP水平升高。Mukoyama等[17]报道，慢性心力衰竭患者血浆脑钠肽水平较正常升高，且与心衰严重程度呈正比。Chang等[18]进一步提出BNP及其前体作为心力衰竭标记物，其诊断价值明显优于传统的诊断方法。在鉴别心力衰竭与其他原因引起的呼吸困难时，脑钠肽水平的升高比左心室射血分数和心钠肽、N末端残片脑钠肽更准确及敏感，其敏感度>90%，其特异性为80～90%[19-20]。BNP在心脏功能受损时会显著增大分泌量和加快分泌速度，能有效调节血容量和心脏功能。因此,BNP可能有助于保护心功能[21-22]。BNP还能减少血管收缩肽产生而促进血管舒张肽的释放从而抗冠状动脉痉挛，可使血管平滑肌松弛，降低血压，减轻心脏的前负荷；抑制心肌细胞纤维化、血管平滑肌细胞增生以及纤维化；抗心肌细胞脂肪分解、抗心肌成纤维细胞DNA合成和细胞增殖，抑制心肌细胞肥大、增生；抑制某些激素的活性；此外，还参与凝血系统和纤溶系统调节，减少内皮功能损伤。脑钠肽清除有两种途径：结合受体或通过中性内肽酶(neutral endopeptidase NEP)使其灭活[23]。研究中还发现:各研究组大鼠血清肌红蛋白(Mb)和肌酸激酶同工酶(BNP)的水平均明显高于对照组大鼠,二者相比差异具有显著性。各研究组大鼠血清中Mb的水平在其滴入毒物后均有升高，均在一定时间内达到峰值,在实验期间逐渐恢复至正常值。血清中BNP水平也存在此类波动变化，BNP达到峰值的时间及逐渐恢复至正常值的时间比Mb水平晚，但升高的幅度更高。汽车尾气组、煤烟组和自然空气组大鼠引起的心肌损害最严重，而汽车尾气的主要成分是一氧化碳、碳氢化合物、氮氧化物、二氧化硫和一些重金属；煤烟的主要成分是碳、氢、氧、氮及硫、磷、氟、氯和砷；自然空气组的主要成分为硫酸盐、硅酸盐、硝酸盐及多种重金属的混合物；说明这些物质引起的心肌细胞损伤较强；燃烧秸秆组引起心肌细胞损伤较弱；以上三组均出现了严重的心肌细胞变性、坏死、纤维化；HM/BM明显升高；心肌细胞存活率明显降低。而燃烧秸秆的主要成分是碳酸钾、氯化钾、氯化镁，说明这些成分造成的心肌细胞损害较弱。心肌病理出现了轻度的心肌细胞水肿、变性，HM/BM无明显升高(P<0.05)，心肌细胞存活率下降不明显(P>0.05)。

4 结论

本资料显示，气管内滴入汽车尾气、煤烟、燃烧秸秆、自然空气颗粒的大鼠，血清中肌红蛋白和脑钠肽水平明显升高。高浓度的汽车尾气、煤烟、燃烧秸秆、自然空气颗粒均可以引起心肌损害，参与了心肌损害过程。检测大鼠血清中肌红蛋白和脑钠肽的水平对判断污染物对大鼠心肌损害程度具有重要意义。