南极磷虾油中磷脂检测方法的比较

苏婷，周德庆，朱兰兰，*，王珊珊

（1．中国海洋大学，山东青岛266100；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛266071）

南极磷虾广泛分布于南极洲水域，隶属于无脊椎动物，节肢动物门、甲壳纲、软甲亚纲、磷虾目，磷虾科，磷虾属[1]，是目前世界上已知的资源储存量最大的生物之一，生物量可达6.5×108t～10×108t[2-3]。南极磷虾富含蛋白质、功能脂质及多种营养活性物质。南极磷虾肉中蛋白质含量高于16%，而干磷虾高达65%；磷脂是南极磷虾重要的营养物质，主要包含磷脂、胆固醇、甘油酯等[4-5]，不饱和脂肪酸约占总脂肪酸的60%，二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA）约占 28.9%[6]。南极磷虾中也含有丰富的维生素以及矿物质，如维生素D、维生素A、磷、钙、铁、硒、碘、镁等，均为人体所需的维生素及矿物质营养成分[7-8]。

南极磷虾资源开发作为战略新兴产业，广受各国关注。我国南极磷虾产业起步较晚，研发的高附加值产品主要为南极磷虾油。与传统鱼油相比，南极磷虾油的磷脂、脂肪酸及虾青素等功能脂质，更易为人体吸收，具有更强的生理活性，在降血脂预防心血管疾病[9-11]、提高记忆力[12-13]、降血糖预防糖尿病[12]、消除炎症[14-15]、抗氧化[15-16]、防止肝脂肪变性[17]等方面表现出众，因而备受消费者青睐。区别于甘油三酯型鱼油，南极磷虾油磷脂与不饱和脂肪酸和虾青素结合在一起，致使常规的磷脂检测方法不适用于南极磷虾油磷脂检测。基于此，比较磷脂的3种检测方法，在综合样品前处理繁简程度、定量分析准确性等因素的基础上，确定南极磷虾油中磷脂的适宜检测分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾油样品：中国水产科学研究院黄海水产研究所食品质量安全实验室制备；磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidyl choline，LPC）、磷脂酰乙醇胺 （phosphatidylethanolamine，PE）标准品：Sigma 公司；磷酸三甲酯、氘代氯仿、盐酸、氧化锌、氢氧化钾、浓硫酸、钼酸钠、硫酸联氨、磷酸二氢钾、氯仿、甲醇、碘（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验仪器

Bruker AV 500核磁共振波谱仪：德国布鲁克公司；GL224分析天平：德国赛多利斯科学仪器有限公司；10*10薄层层析硅胶板：烟台江友硅胶开发有限公司；UV1102Ⅱ紫外/可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 核磁共振法定性定量检测磷脂

称取磷酸三甲酯30.5 mg加入4 mL氘代氯仿配成内标储备溶液待用。取0.025 g左右虾油加入900 μL氘代氯仿复溶，加入内标储备溶液100 μL，振荡/超声，针管吸出过0.22 μm的滤膜，转移至5 mm的核磁管。通过对比样品与标准品相对于内标物的化学位移，对样品磷脂进行定性分析。

检测条件：测定温度25℃，谱宽40 000 Hz，检测频率 202.416 MHz，脉冲宽度 12.5 μs，采集时间 0.4 s，延迟时间3.5 s。

磷脂含量的计算：核磁共振谱分析中，磷原子数与其对应峰面积成正比，而每个样品磷脂分子中仅含有一个磷原子，内标物中也仅有一个磷原子，因此通过对内标物和样品中各个峰进行积分，比较内标峰与样品峰的峰面积，计算含量。代入公式（1）、（2）计算即可得到：

式中：ma为组分a的质量，mg；Sa为组分a的峰面积；S内标为内标物的峰面积；n内标为内标物的摩尔量，mol；M内标为组分 A 的摩尔质量，mg/mol。

组分a的含量：

式中：Xa为组分a的含量，mg/g；ma为组分a的质量，mg；m虾油为虾油的质量，g。

1.3.2 钼蓝比色法检测磷脂总量

样品前处理：称取2.0 g～3.0 g南极磷虾油于坩埚中，加入0.5 g ZnO，碳化后马弗炉560℃加热至样品完全灰化变成白色，冷却至室温，加入10 mL体积比1∶1的盐酸反应，依次加入50%的氢氧化钾溶液、体积比1∶1的盐酸至溶液澄清。用水稀释定容至刻度，摇匀。

标准曲线绘制：取6支比色管，分别加入0.01mg/mL的磷酸二氢钾标准溶液，加入0.015%的硫酸联氨溶液，2.5%钼酸钠稀硫酸溶液，沸水浴中加热10 min，冷却至室温，用水定容。在650 nm下测吸光度，以吸光度为纵坐标，含磷量为横坐标绘制标准曲线。

样品测定：取待测溶液10 mL于50 mL比色管中，依照标准曲线绘制中的样品处理方式处理，用空白调零，在650 nm下测吸光度。

1.3.3 薄层层析法定性半定量磷脂

定性分析：分别取5.0 mg左右磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、溶血磷脂酰胆碱标准品（LPC）溶于氯仿制成标准溶液，混合制成混标。硅胶板毛细管点样后，放入层析缸中展开，展开剂为氯仿：甲醇：水体积比60∶30∶10，之后碘缸中显色半小时，比较样品与标准品斑点的位置。

定量分析：将显色后的硅胶板放在光线均匀分布的拍照箱里，对其进行拍照，利用Gelpro32软件对照片中样品条带的灰度值进行分析。

2 结果与分析

2.1 核磁共振定性定量分析南极磷虾油磷脂组成

核磁共振定性定量分析南极磷虾油磷脂组成见图 1、图 2。

采用内标法，将样品31P NMR谱图峰面积与已知含量的参比峰峰面积积分，计算磷脂含量，结果如表1所示。

样品1～4的磷脂组成及总磷脂含量差异显著。样品 3磷脂总含量最低，仅有（90.52±0.28）mg/g；样品 2磷脂总含量最高，达（382.73±0.68）mg/g。4个样品的磷脂组成组成规律一致，含量排序均为PC＞LPC＞PE，但样品中各磷脂成分的含量差异显著，PC含量范围在（76.26±0.23）mg/g～（302.28±0.47）mg/g，PE 含量范围在（6.03±0.09）mg/g～（40.78±0.18）mg/g，LPC 含量范围在（8.22±0.10）mg/g～（87.36±0.26）mg/g。

图1 各磷脂标准品31P NMR谱图Fig.1 31P NMR spectra of standards

图2 样品的磷脂组成31P NMR分析Fig.2 Analysis of phospholipids in sample with31P NMR spectra

表1 核磁共振测南极磷虾油样品磷脂含量Table 1 The phospholipids composition of four samples by31P NMR

2.2 钼蓝比色法测定南极磷虾油磷脂总量

用钼蓝比色法对4个样品进行磷脂总量的检测，结果见表2。

表2 钼蓝比色法测南极磷虾油样品总磷脂含量表Table 2 The total phospholipid content of sample by molybdenum blue colorimetry

不同样品间的总磷脂含量差异显著。样品2含量最高，为（470.53±1.3）mg/g；样品3含量最低，为（189.47±0.8）mg/g。该方法仅能测出南极磷虾油的总磷脂含量，并不能对磷脂的组成进行分析。

2.3 薄层层析定性半定量分析南极磷虾油磷脂组成

2.3.1 薄层层析定性分析南极磷虾油磷脂组成

将3个磷脂标准品及混合标准品点样展开后经碘缸显色得到图3，将4个样品及混合标准品点样展开后经碘缸显色得到图4。

图3 PC、PE、LPC、混标的薄层色谱图Fig.3 TLC chromatogram of phospholipid standards

图4 样品及标准品的薄层色谱图Fig.4 TLC chromatogram of samples and phospholipid standards

两图对比结果显示：4个样品中均含有PC（磷脂酰胆碱）、PE（磷脂酰乙醇胺）、LPC（溶血磷脂酰胆碱）。图4中PE的斑块中间相较于两边有些偏下，分析可能是层析缸中的展开剂未完全饱和，蒸汽分布不均匀，导致产生了边缘效应。

2.3.2 薄层层析结合Gelpro32半定量分析磷脂组成含量

对4个样品中磷虾油的组成进行多次薄层层析分析，借助Gelpro32软件分析薄层层析图中各样品条带的斑点，得到PC（磷脂酰胆碱）、PE（磷脂酰乙醇胺）、LPC（溶血磷脂酰胆碱）的相对含量，结果见表3。

表3 薄层色谱-Gelpro32分析南极磷虾油样品中各磷脂组分含量百分比Table 3 Percentage of 3 kinds of phospholipid content of 4 samples by TLC-Gelpro32

由表3可知，各样品中磷脂各组分含量排序均为PC＞LPC＞PE，但各组分含量差异显著。这与核磁共振检测的结果一致。

2.4 3种方法分析南极磷虾磷脂的结果比较

对核磁共振法和钼蓝比色法测定磷脂含量的结果进行了比较分析，结果如表4所示。

表4 31P NMR和钼蓝比色法分析南极磷虾油样品结果Table 4 The phospholipid composition of Antarctic krill oil analyzed by31P NMR and molybdenum blue colorimetric methods

2种检测方法测得的总磷脂含量差异显著。钼蓝比色法检测的4个样品总磷脂含量均高于31P NMR的检测结果，分析是该方法基于磷元素与磷脂的当量关系，根据磷元素含量确定磷脂含量，致使测定结果偏高。根据各磷脂占磷脂含量总和的百分比，对31P NMR法和TLC法测定的磷脂各组分含量进行对比，结果见表5。

表5 31P NMR和TLC法分析南极磷虾油样品结果Table 5 The phospholipid composition of Antarctic krill oil analyzed by31P NMR and TLC

31P NMR法和TLC法均分析出4个样品由3种磷脂组成，且各磷脂组分含量的趋势一致，均为磷脂酰胆碱含量＞溶血磷脂酰胆碱＞磷脂酰乙醇胺，但2种方法检测磷脂各组分含量的差异显著。TLC检测结果整体比31P NMR法低，分析是检测受碘显色的影响，且定量过程受软件对斑点的识别影响，进而影响了定量准确性。

3 结论

采用3种检测方法对南极磷虾油磷脂的组成及含量进行分析，结果显示：钼蓝比色法仅能测定样品中总磷脂含量，无法进行磷脂组成分析；薄层色谱法可以分析磷脂组成，但仅能实现磷脂含量半定量；核磁共振法可以实现磷脂的准确定量及磷脂的组成分析。核磁共振与薄层色谱法分析南极磷虾油磷脂组成结果一致，磷虾油中磷脂主要由PC（磷脂酰胆碱）、PE（磷脂酰乙醇胺）和LPC（溶血磷脂酰胆碱）组成。综合样品前处理繁简程度、定量分析准确性等因素，确定核磁共振法作为南极磷虾油中磷脂的含量及组成的检测分析方法。