NLRP3炎症小体与炎症性肠病的关系及针灸调节作用研究进展

吴丽洁,张霁,张丹,杨延婷,杨玲,智方圆,吴凌翔,谢晨,马晓芃,



NLRP3炎症小体与炎症性肠病的关系及针灸调节作用研究进展

吴丽洁1,张霁1,张丹2,杨延婷1,杨玲2,智方圆1,吴凌翔2,谢晨2,马晓芃1,2

(1.上海中医药大学,上海 201203;2.上海市针灸经络研究所,上海 200030)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组慢性非特异性肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。炎症小体作为一种大分子复合蛋白,在炎症发生发展与机体固有免疫中发挥了重要作用。其中NLRP3在IBD的发生发展与维持肠道稳态的作用机制中起到了双向调节的作用。该文综述了NLRP3炎性小体在IBD中的研究进展以及针灸对其的调节作用及可能机制,以期为针灸治疗炎症性肠病的临床和机制研究提供新思路。

炎症性肠病;针灸疗法;炎症小体;NLRP3

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组影响胃肠道功能的慢性炎症性疾病,主要包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)[1]。其发病机制尚未完全明确,可能与肠道上皮屏障功能的改变、肠道微生物失调、肠道先天免疫和饮食等因素相关[2]。NLRP3作为炎症小体的其中一个亚型,是目前研究最多也是最具特点的一员,对炎症性肠病的调控具有双向调节作用[3]。大量的临床实践已证明,针灸治疗炎症性肠病疗效确切[4-27],机制研究也逐步深入。探讨NLRP3在IBD中的分子调节机制以及针灸干预作用,为针灸治疗IBD提供可靠的科学依据具有重要意义。

1 NLRP3炎症小体的组成

NLRP3炎症小体是一种存在于细胞质中的蛋白复合物,由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)以及半胱天冬肽酶-1(caspase-1)前体蛋白结合而成。NLRP3由C端亮氨酸重复序列(LRR)和核苷酸寡聚化结构域(NACTH)以及N端效应结构域(PYD)组成[28],其中PYD连接ASC的PYD结构域后,ASC的C端CARD(caspase recruitment domain)结构域招募caspase-1前体,进而激活caspase-1,实现炎症小体NLRP3的装配[29]。静息状态时,NLRP3处于无活性状态,只有被激活后才能转化为炎症小体发挥作用,具体的激活物分为病原相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs),其中PAMPS主要包括金黄色葡萄球菌、B组链球菌、李斯特氏菌、病毒[30-33]等;DAMPS主要包括尿酸或胆固醇结晶、b淀粉状蛋白、三磷酸腺苷(ATP)等[34-36]。当PAMPs或DAMPs被Toll样受体(第一信号)识别后,激活核转录因子NF-kB,启动NLRP3、pro-IL-1b和pro-IL-18等的转录过程,进而上调炎症小体的表达水平。第二信号(ATP,某些细菌毒素或颗粒物质)介导NLRP3的寡聚化,将NLRP3、ASC和caspase-1前体蛋白装配成复合物,引起caspase-1的活化以及IL-1b和IL-18的分泌[37-38]。

2 NLRP3炎症小体的激活途径

目前,NLRP3炎症小体主要存在4种激活路径。①细胞外的ATP(三磷酸腺苷)充当NLRP3受体激动剂,通过结合表面受体P2X7,使离子通道打开。同时,细菌毒素使细胞膜形成空隙,从而诱导K﹢外流,从而导致NLRP3炎症小体的组装和激活。可以认为,K﹢外流是NLRP3炎症小体的主要催化剂,而细胞外ATP和成孔毒素是炎症因子分泌的主要诱因[39]。②在PAMPs和DAMPs影响下,损伤的线粒体激发活性氧(ROS)、线粒体DNA和心磷脂的产生,作为激活NLRP3炎症小体的关键信号导致NLRP3装配和激活[40-41]。③结晶或颗粒结构(如二氧化硅、石棉、淀粉样蛋白b和明矾等)刺激吞噬细胞内环境的稳定,引起溶酶体破裂,组织蛋白酶B释放到细胞质中,直接激活炎性小体[42]。④Ca2﹢通量和Ca2﹢依赖性信号触发NLRP3炎症小体组装[43-44]。

最近的研究表明,NIMA相关激酶(NEK)家族的成员NEK7直接与NLRP3的LRR结构域结合,在K﹢外排和ROS产生作用下,完成炎症小体的组装与激活[45]。Wang W等[46]发现EV71(肠道病毒71)3D蛋白作为RNA依赖性RNA聚合酶,通过直接结合NLRP3刺激NLRP3炎性细胞的活化。除此之外,自噬功能障碍、线粒体钙离子超载引起的功能失调、TXNIP的活化、PYD结构域的磷酸化、高尔基体介导的蛋白激酶D信号传导、氯离子等因素也可以激活NLRP3炎症小体[47-51]。NLRP3炎症小体组装与激活途径如图1所示。

然而NLRP3炎症小体的不适当激活会破坏先天性免疫应答在人体的防御作用,研究表明,胰腺癌、动脉硬化、糖尿病、慢性肝病、帕金森等自身免疫相关性疾病都与其相关[52-56]。

3 NLRP3的负调控途径

近几年发现,NLRP3的激活可以被自噬等多种调控途径所抑制。自噬作为一种自我降解过程,在某些条件下,可以选择性去除特定的蛋白质和受损的细胞器(如线粒体)[57],从而维持细胞代谢平衡,实现内环境稳态。自噬由4个连续步骤组成,自噬体的形成,自噬膜的伸长和闭合,自噬体和溶酶体之间的融合以及降解,这种复杂过程在哺乳动物中至少由18个自噬相关基因(Atg基因)介导[58]。最近的研究已经确定了自噬相关基因在NLRP3炎症细胞活化中的关键作用,如Saitoh T等[59]发现Atg16L1可以通过促进自噬体P62的降解来抑制IL-1b的分泌;van der Burgh R等[60]发现Atg7缺陷导致线粒体受损,NLRP3炎症体活化,与自噬可以通过清除损伤的线粒体直接抑制NLRP3炎症体激活的结论一致[61]。有研究[61-62]发现3MA(PI3K抑制剂)抑制自噬增加了mtROS的产生,导致在没有炎性体刺激的情况下,NLRP3依赖性IL-1b分泌;在干预结核分枝杆菌感染的细胞时,3MA阻断自噬体形成导致IL-1b分泌增加。Spalinger MR等[63]发现PTPN22(蛋白酪氨酸磷酸酶,非受体型22)的丧失通过自噬途径,增强的NLRP3磷酸化水平抑制NLRP3炎症体的激活。除此之外,作为Fork框架转录因子家族的成员,Foxo3a在营养缺乏条件下参与自噬形成。研究证实,Foxo3a在细胞核中被抑制使自噬功能受损,NLRP3炎症细胞在KCs中被激活;Foxo3a的过表达恢复自噬通量,并通过促进Bim的转录来减弱NLRP3炎症细胞的活化[64]。

注:红色箭头与字体为第一信号,黑色为第二信号,①②③④为主要激活途径

除自噬外,泛素相关蛋白可以负调控NLRP3的激活。E3泛素连接酶TRIM31(三分体基序蛋白31)被认为是NLRP3炎症反应抑制因子,它可以直接结合NLRP3,促进NLRP3的K48连锁聚泛素化和蛋白酶体降解,同时,TRIM31缺乏可以减轻DSS诱导的结肠炎[65]。另外,TRIM30通过抑制细胞内ROS的产生,从而抑制NLRP3炎症小体激活[66]。

此外,NO与CO以及Nrf2(核转录因子E2相关因子2)通过抑制线粒体中ROS的产生,线粒体膜电位,和线粒体DNA在巨噬细胞中的胞内易位,维持线粒体稳定来抑制NLRP3的表达,ASC的装配和IL-1b分泌达到负调控的作用[67-69]。研究发现,NLRP3炎症体激活物触发Src同源2域包含蛋白酪氨酸磷酸酶-2(SHP2)易位到线粒体,与腺嘌呤核苷酸translocase 1(ANT1)相互作用和去磷酸化抑制线粒体膜电位以及线粒体DNA和活性氧的释放,从而防止NLRP3炎症小体的过度激活[70]。

4 NLRP3炎症小体与IBD的关系

近几年的研究发现,NLRP3在IBD的发病与炎症中具有促进炎症与维持肠道稳态的双重作用[3]。

4.1 NLRP3在IBD病理学中的促炎作用

研究显示,在CD患者和患有急性或慢性结肠炎小鼠的结肠组织中存在NLRP3的高表达[33,71-73]。与NLRP3相关NLRs家族中的NOD1和NOD2存在于细胞质中,它们分别识别细菌肽聚糖、胞壁酰二肽,Paneth细胞、上皮细胞和抗原呈递细胞中的转录因子NF-kB和AP-1被活化,导致促炎因子IL-b的释放[74]。DE la Fuente M等[75]发现从IBD患者分离的大肠杆菌菌株可以通过NLRP3炎症小体诱导小鼠巨噬细胞的IL-1b分泌。Liu W等[76]使用NLRP3依赖的pro-caspase-1、IL-1b和IL-18的抑制剂Fc11a-2来治疗模型小鼠,急性结肠炎的症状得到减轻。Bauer C等[77]发现,与正常小鼠对比,NLRP3-/-小鼠在DSS造模的情况下,结肠炎的严重程度明显下降。以上这些研究均提示,NLRP3对结肠炎的发生发展具有促进作用,且可以作为开发IBD患者的新型治疗剂的潜在靶标。

4.2 NLRP3维持肠道内稳态作用

NLRP3在调节肠内稳态中起着关键作用,维持肠道上皮屏障完整性并降低实验性结肠炎期间的死亡率,并影响肠道内生物群的组成[48,78-80]。研究发现携带NLRP3 R258W突变的CAPS模型小鼠通过调节性T细胞(Treg细胞)诱导IL-1b的分泌增加,促进局部抗微生物肽促进微生物群的重建,从而维持肠道稳态[81]。有学者[78-79,82]发现和NLRP3-/-、ASC-/-和caspase-1-/-小鼠对葡聚糖硫酸钠(DSS)和2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎更易感染,小鼠肠道上皮细胞增殖缺陷,上皮屏障功能减弱,细菌的透过率升高,从而使易感性增加。除此之外,NLLRP3-/-小鼠在NO合成酶(iNOS)活性增加的诱导情况下,NO水平升高,IL-10和TGF-b表达降低,从而表明NLRP3可以在肠炎中下调炎症反应,在肠内稳态中起关键作用[79]。在恶唑酮(OXA)诱导的结肠炎WT小鼠模型中,外源性IL-1b、IL-18可通过调节Th2细胞因子的表达,降低结肠炎的严重性。而NLRP3-/-小鼠结肠炎的严重性与Th2细胞因子的表达呈正相关。这提示NLRP3衍生的IL-1b、IL-18可以通过不同的机制抑制Th2细胞因子产生,减轻肠道损伤[83]。研究还发现NLRP3炎症小体可以调节上皮细胞的衍生物IL-18的分泌,来维持肠道稳态[84]。以上研究均提示NLRP3炎症小体对实验性结肠炎有保护作用。

随着研究的深入,虽然研究者对NLRP3炎症小体有了较多的认识,但其在IBD中的作用机制尚不明确,对于NLRP3炎症小体表达水平对结肠炎的影响仍然存在争议。特别是在NLRP3-/-小鼠结肠炎模型中的结果差异,可能与诱导结肠炎的方案、实验条件、遗传背景和所使用的动物的性别以及不同小鼠之间不同微生物群落等差异相关[85]。所以如要确定NLRP3炎症小体在稳定状态条件下和在IBD中发挥的作用需要做进一步的研究。

5 针灸对炎症性肠病NLRP3炎症小体的作用与展望

目前,针灸对炎症性肠病NLRP3炎症小体是否有调节作用尚未见有报道,但业已证实针灸对NLRP3信号通路的激活因素、下游炎症因子以及负调控的相关因素,有一定的调节作用,提示调节NLRP3炎症小体及相关信号通路可能是针灸治疗IBD的重要效应机制。

NF-kB与NLRP3炎症小体的组装与激活相关,研究发现针灸对IBD核转录因子NF-kB及下游炎症因子有调节作用。

在克罗恩病中,研究发现电针刺激足三里、曲池穴能够减轻TNBS诱导的结肠病变,与其下调IL-1b的表达,以及抑制p-IkBa和NF-kB p65等蛋白表达水平相关[86];艾灸天枢、气海穴,能下调克罗恩病大鼠结肠NF-kB p65、TNF-a、IL-1b的表达,提示艾灸可能通过抑制克罗恩病大鼠结肠NF-kB p65的表达,进而减少其下游炎症因子TNF-a、IL-1b的表达,从而减轻肠道炎症,改善结肠组织形态结构,发挥治疗作用[87]。在溃疡性结肠炎中,研究发现,电针上巨虚能调节溃疡性结肠炎IL-1b的异常表达,改善结肠黏膜损伤[88];大鼠溃疡性结肠炎的发生涉及多种基因的表达异常,隔药灸可通过调节IL-1b等诸多基因表达起到治疗作用[89]。艾灸可通过抑制结肠组织NF-kB p65转录而下调TLR-9表达,从而修复UC大鼠受损黏膜上皮,抑制血清中IL-8含量,提高血清中IL-10含量,且灸量越大效果越明显[90]。还有研究发现调控TLR/MyD88/NF-kB信号转导通路中MyD88、TRAF6的表达是隔药灸调节溃疡性结肠炎结肠黏膜局部过激免疫炎症反应的作用途径之一[91]。

除此之外,针灸对NLRP3负调控途径的相关因素也有一定的作用。有研究发现,在金黄色葡萄球菌引起的巨噬细胞感染中,温和灸可以下调IL-1b、iNOS以及caspase-1的表达,减轻炎症;除此之外还证实了,温和灸是通过下调自噬mTOR通路中Akt的磷酸化水平来起到作用的[92]。

综上所述,针灸对NLRP3炎症小体下游炎症因子、调控途径均有一定的调节作用。NLRP3炎症小体作为系列炎症反应的核心,可能是针灸防治炎症性肠病新的重要靶点。探讨艾灸调节炎症小体及其相关信号通路治疗炎症性肠病的效应机制,对于炎症性肠病的防治至关重要。以NLRP3炎症小体为介入点,观察针灸对炎症性肠病NLRP3炎症小体及上下游通路信号分子的调节作用,阐释针灸对NLRP3炎症小体调控的分子机制,有助于进一步阐明针灸防治炎症性肠病的作用机制,为临床炎症性肠病的针灸治疗提供科学证据。

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Research Advances in the Relationship Between NLRP3 Inflammasome and Inflammatory Bowel Disease and the Regulating Effect of Acupuncture and Moxibustion

1,1,2,1,2,1,2,2,1,2.

1.201203,; 2.200030,

Inflammatory bowel disease (IBD) is a group of chronic nonspecific inflammatory intestinal diseases including Crohn's disease (CD) and ulcerative colitis (UC). The inflammasome is macromolecular multiprotein and plays an important role in inflammatory occurrence and development and bodily innate immunity. NLRP3 inflammasome produces a bidirectional regulating effect in the occurrence and development of IBD and the mechanism of maintaining intestinal homeostasis. This article reviews research advances in NLRP3 inflammasome in IBD, and the regulating effect of acupuncture and moxibustion on it and the possible mechanism to provide a new idea for clinical and mechanism studies of acupuncture-moxibustion treatment for inflammatory bowel disease.

Inflammatory bowel disease; Acupuncture-moxibustion therapy; Inflammasome; NLRP3

1005-0957(2018)08-0961-08

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.08.0961

2018-03-20

国家自然科学基金项目(81674073,81273843);国家重点基础研究发展计划项目(2015CB554501);上海市卫生和计划生育委员会项目(2017BR047)

吴丽洁(1990—),女,2017级博士生,Email:wljzwb@163.com

马晓芃(1973—),女,研究员,博士生导师,Email:pengpengma@163.com