陕产延胡索产地加工与炮制一体化 HPLC指纹图谱研究

宋艺君，郭涛，孙婧，王志彦，李积秀

(1.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；2.解放军第451医院，陕西 西安 710054)

中药材生产中有产地加工和炮制两个重要环节。产地加工方法通常有净制、干燥等，有些药材需通过蒸、煮等方法来处理。中药炮制有净制、软化、切制、干燥、炮制等工序，同样也有蒸煮等加热炮制手段。中药材从产地加工到炮制，经过反复加工处理，势必会影响有效成分的含量。近年来，有专家提出“中药材产地加工与炮制一体化”，国家中医药管理局也专门设立了“中药材产地加工与炮制一体化”行业专项。通过中药材产地加工与炮制一体化研究，省去浸泡软化工序，缩短了干燥时间，避免了有效成分的流失，节省了人力物力，降低了中药饮片成本，提高了中药饮片质量，从而确保中药饮片的临床安全、有效。

延胡索来源于罂粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)，药用部位是块茎，主产于浙江、陕西、安徽等地。近年来，随着栽培面积的增加，陕产延胡索已达全国延胡索总量的70%[1]。延胡索味辛、苦，性温，具有活血利气、止痛的作用[2]。临床主要用于胸胁、脘腹疼痛、胸痹心痛、产后瘀阻等证的治疗。药理研究表明，延胡索生物碱对心血管[3-4]、神经[5-6]、消化[7]、内分泌等系统均具有明显的作用[8-9]。

目前，关于延胡索指纹图谱的研究主要集中在不同产地延胡索药材、鲜品与炮制品的对比、生品和制品延胡索质量差异分析[10-13],但延胡索产地加工与炮制一体化的指纹图谱研究还未见报道。本课题组前期对延胡索产地加工工艺进行了研究[14]，后期采用醋炙法、醋蒸法等炮制方法对其炮制，并对不同炮制方法对其质量的影响进行了比较分析，本文在此基础上对延胡索产地加工与炮制一体化进行系统研究。本实验选取陕产延胡索，以其所含的两种生物碱对照品作为指示，对其不同的产地加工与炮制一体化样品进行指纹图谱分析，为延胡索饮片的质量控制和评价提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪(Waters公司)；BT-25S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ-500E型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药品及试剂

延胡索采自陕西城固县，经陕西中医药大学药学院胡本祥教授鉴定为罂粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang)的干燥块茎；延胡索乙素对照品(批号110726-201616)、原阿片碱对照品(批号110853-201604)均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 延胡索产地加工与炮制一体化工艺样品的制备

新鲜延胡索:取新鲜延胡索100 g，除去杂质，洗净，切片，干燥。醋炙鲜药：取新鲜延胡索100 g，加入醋拌匀(20 ml)，闷润至醋被吸收完全后，置炒制容器内用文火加热炒干，取出晾凉，切片。醋煮鲜药：取新鲜延胡索100 g，加入醋(20 ml)与适量水(平药面)，置煮制容器内煮至透心。待醋液被吸尽时，取出，晾至六成干，切片，干燥。水煮延胡索：取新鲜延胡索100 g，煮至透心，晾至六成干，切片，干燥。醋煮水煮品：取水煮延胡索100 g，按照(醋煮鲜药)同法处理。醋炙水煮品：取水煮延胡索100 g, 按照(醋炙鲜药)同法处理。传统加工炮制：取新鲜延胡索100 g，置沸水中煮至恰无白心时，取出，干燥，再加适量水软化，切片，干燥。

2.2 色谱条件[15]

Hypurity C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺调节pH值6.0)，线性梯度洗脱(见表1)，流速1.0 ml/min，检测波长280 nm，洗脱时间75 min，柱温30℃，进样量10 μL。

表1 流动相线性洗脱梯度

2.3 对照品溶液的制备

取延胡索乙素、原阿片碱对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成含延胡索乙素61.8 μg/ml、原阿片碱109.6 μg/ml的混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

取样品0.5 g，精密称定，置圆底烧瓶，加入浓氨试液-甲醇(1∶20)混合液50 ml，称重，浸渍1 h后加热回流1 h，放凉后再称重，补足重量，摇匀，滤过。量取续滤液25 ml，于蒸法皿蒸干，用甲醇溶解定容到容量瓶(5 ml)中，滤过，取续滤液，即得。

2.5 指纹图谱方法学考察

2.5.1 空白溶剂的考察

取甲醇溶液，在已确定的色谱条件下进样，结果表明溶剂对色谱峰无干扰。

2.5.2 精密度试验

取延胡索样品S3，按“2.4项”下方法制备供试品溶液，连续进样6次，结果各共有峰相对峰面积及相对保留时间的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验

取延胡索样品S3，按“2.4项”下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，结果各共有峰相对峰面积及相对保留时间的RSD均小于3 %，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验

取延胡索样品S3，按“2.4项”下方法制备供试品溶液6份，分别进样，结果各共有峰相对峰面积及相对保留时间的RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.6 指纹图谱的建立与分析

2.6.1 指纹图谱的建立

取延胡索样品7批，按照“2.4项”下方法制备供试品溶液并测定，记录色谱图，将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)进行分析，以延胡索样品(S3)的指纹图谱为参照图谱，采用中位数矢量法进行多点校正生成对照指纹图谱，7批延胡索 HPLC指纹图谱共有模式及对照指纹图谱见图1。

图1 7批延胡索样品指纹图谱共有模式(A)及对照指纹图谱(B)

图2 混合对照品HPLC图注：1.原阿片碱；2.延胡索乙素

2.6.2 共有峰的标定

据7批延胡索样品的检测结果，采用相似度评价软件的数据匹配功能，在对照指纹图谱上标定出17个共有色谱峰，见图1(B)。取混合对照品溶液，进样，记录色谱图，见图2。将混合对照品溶液与样品色谱图进行比对，在已确定的17个共有峰中，指认出2个成分，其中6号峰为原阿片碱，13号峰为延胡索乙素，其余为未知峰。在样品图谱中选择峰面积较大，出峰时间适中的8号色谱峰作为参照峰(S)，以参照峰的峰面积和保留时间作为1，分别计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间，见表2～3。结果其共有峰相对保留时间的RSD小于1%，相对峰面积的RSD在4%～29%，结果表明不同的产地加工与炮制一体化工艺得到的饮片成分相似，共有成分的相对质量分数差异较大，推测可能由于受到不同的加工炮制方法的影响。

表2 共有峰的相对保留时间

表3 共有峰的相对峰面积

2.6.3 相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)软件，将7批延胡索样品指纹图谱数据导入，以中位数矢量法生成对照指纹图谱。由于采用梯度洗脱的方式及实验中不可避免因素的影响，各供试品指纹图谱色谱峰保留时间会产生一定迁移，因而不采用自动校正的方式，而是通过多点校正法对色谱峰保留时间进行校正，以S3作为相似度计算时校正的参考，最终生成延胡索产地加工与炮制一体化样品的对照指纹图谱。计算各批次延胡索样品的指纹图谱相似度，结果表明有较高的相似性，见表4。由相似度结果可知，以上样品与对照谱相比较，除S1样品外，其余6批样品与对照指纹图谱的相似度均大于0.9，与对照指纹图谱有较好的相似性，表明这几种处理方法差异较小，而S1样品与对照指纹图谱的相似度小于0.9，可能是因为S1样品是鲜品，与其它样品的处理方法相比相差较大。

2.6.4 系统聚类分析

以标定的共有峰的峰面积为变量，采用组间联接法，以欧式距离的平方为测度，采用SPSS19.0统计软件，进行系统聚类分析，结果见图3。由图3峰面积聚类结果可以看出样品可分为三类， 2，3，5，1样品为第一类， 4，6样品为第二类， 7样品为第三类。结合相似度分析结果可知三类共有峰的峰面积相比是有差异的，可能与加工方法不同有关。聚类分析得到样品之间的相关性与相似度的计算结果较为一致。

表4 7批延胡索样品指纹图谱相似度计算结果

图3 系统聚类分析结果

3 讨论

3.1 提取和分析方法的考察

采用浓氨试液-甲醇(1∶20)和浓氨试液-乙醇(1∶20)提取溶剂加热回流提取，结果采用浓氨试液-甲醇(1∶20)提取溶剂出峰数较多且分离度好，所以选择浓氨试液-甲醇(1∶20)作为提取溶剂。

分析比较甲醇-水，乙腈-水两种流动相系统表明，延胡索样品在乙腈-水体系下出峰较多且色谱峰分离较好，所以采用乙腈-水体系作为流动相系统。

在配置流动相时，刚开始采用pH试纸调节pH值，结果发现，色谱图重复性不好，而且每换一次流动相，色谱峰峰位、峰形就会有所变化，后来采用精密pH计调节流动相pH值，由于pH值调节准确，生物碱在pH值6.0可以完全处于解离状态，能够在色谱图上很好的呈现出来，且色谱峰峰位、峰形稳定。

设定不同的洗脱梯度，根据其洗脱梯度下的色谱峰的峰形及分离度，最终确定最佳洗脱梯度为“2.2项”下梯度。

3.2 指标性成分的选择

费艳美等[10]以延胡索乙素、原阿片碱为指标性成分，建立延胡索药材指纹图谱。实验研究表明，延胡索乙素、原阿片碱等均为延胡索中有效成分，有较好的药理作用。延胡素乙素[16]通过调节大鼠脑缺血-再灌注过程中细胞膜Na+-K+-ATP 酶和Ca2 +-ATP 酶的活性、拮抗钙离子两方面减轻脑缺血-再灌注损伤，且对小鼠肝损伤也具有保护作用[17]，原阿片碱和延胡索乙素对结扎幽门等多种原因诱发的胃黏膜损伤具有明显的保护作用[18]。这些有效成分在建立的指纹图谱中都有较好的显示，故将其作为指标性成分。

3.3 指纹图谱研究

本实验采用HPLC法，通过查阅文献和全波长扫描的方法共同确定了指纹图谱检测波长，以延胡索乙素、原阿片碱作为指标性成分而建立指纹图谱，确定了17个共有峰。延胡索样品相似度评价结果表明，与对照指纹图谱相比，除S1样品外，其余样品的相似度高(0.9～1.0)，表明经过进一步加工炮制后的样品相似度较好，且各个共有峰保留时间稳定，符合指纹图谱技术要求。延胡索新鲜品(S1)直接净制，切片，未经过进一步炮制加工，所以其指纹图谱和对照指纹图谱相比相似度较低。

本实验比较了延胡索不同产地加工与炮制一体化样品的指纹图谱，相似度高，其共有峰相对保留时间的RSD均小于1%，但相对峰面积的RSD差异较大，表明各种加工炮制方法得到的药材成分相似，但各共有成分的量比例差异较大，可能是受到不同的加工炮制方法的影响。

4 结论

本实验采用HPLC法，建立了延胡索不同产地加工炮制品的指纹图谱，标定了17个共有峰，指认了其中的2个成分，相似度较好，聚类分析结果与相似度评价结果基本一致，该研究建立的延胡索HPLC指纹图谱可为其鉴别和质量评价提供重要参考。

对比新鲜延胡索(S1)和进一步加工炮制后的延胡索样品的指纹图谱可以看出，加工炮制对延胡索的HPLC图谱有影响。相对于新鲜延胡索S1，进一步炮制加工后的延胡索样品的HPLC色谱峰明显不同，炮制后的延胡索乙素和原阿片碱的色谱峰峰面积增加，但是前者增加的幅度更大一些。另外，其他色谱峰峰面积也有所变化，对于其成分的定性尚需进一步研究。