健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠CD40表达的影响

刘杰民，张瑜，古娟，钟日君，王敏，赵琦，蔺晓源

(1.贵州省人民医院，贵州 贵阳 550002；2.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002； 3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；4.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是以持续或反复发作的腹痛腹泻、黏液脓血便、里急后重等为主要临床表现的非特异性肠道炎症性疾病[1]。目前UC尚无根治的疗法，且易反复发作，治愈难度极大，给患者的身心健康带来严重伤害。虽然UC的发病机制尚未完全明确，但免疫因素是其公认的致病机制。CD40分子是免疫应答中重要的共刺激分子，在免疫应答过程中发挥积极作用，其表达异常在UC的发病中被证实起重要作用[2]。董菲洛教授(贵州省名老中医)临床使用健脾益肠散治疗UC效果显著，本研究通过观察该临床经验方对UC模型大鼠CD40蛋白和mRNA表达的影响，以期进一步明确其治疗UC的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只，购于重庆腾鑫华阜实验动物销售有限公司，实验动物许可证号SCXK-(军)2012-0011，体质量(200±20)g。

1.2 药物

健脾益肠散所用药材(黄芪、太子参、焦白术、白豆蔻、木香、败酱草、茯苓、芡实、补骨脂、炙甘草)均购自贵阳中医学院第一附属医院中药药房，经鉴定符合2015年版《中国药典》标准，按传统方法煎煮、过滤、合并滤液，浓缩制成生药含量分别为15 g/mL，10 g/mL，5 g/mL的高、中、低剂量组药液，置于4℃冰箱储藏。柳氮磺吡啶肠溶片(上海福达制药有限公司，国药准字H31020840)；用超纯水配制成浓度为0.022 1 g/mL的药液置于4℃冰箱储藏。

1.3 主要试剂与仪器

2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS，Sigma)；CD40兔抗多克隆抗体(abcam)；逆转录试剂盒(Takara)；PCR试剂盒(KAPA Biosystems)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Bioswamp)；蛋白质Marker(Thermo)。

RM2235型石蜡切片机(德国,Leica)；BX51显微镜和图像分析系统(日本,Olympus)；Realplex2型荧光定量PCR仪(德国,艾本德)；Bio-Rad蛋白印记系统、化学发光系统(美国,伯乐)；Z32HK高速冷冻离心机(德国,Hermle)。

1.4 分组与造模

将60只大鼠按体质量用计算机EXCEL表随机数字法分为空白组,模型组,西药组和健脾益肠散高、中、低剂量组6组;每组10只。参考文献方法[3]制备UC大鼠模型：10%水合氯醛(3 mL/kg)注射麻醉，用大鼠灌胃针插入肛内8 cm 处，以4 mL/kg剂量注入TNBS溶液(5%TNBS与50%乙醇以1∶1体积配制) 后，提尾倒立5 min。空白组大鼠注入等剂量的生理盐水。

1.5 给药

除空白组外，其余各组自造模第3天开始，按照13.6 mL/kg体积量灌胃，连续21 d。模型组给予蒸馏水；西药组给予柳氮磺吡啶肠溶片溶液(0.3 g/kg，成人临床等效剂量)，中药高、中、低剂量组分别给予不同浓度(204 g/kg，136 g/kg，68 g/kg，相当于成人临床等效剂量的15，10，5倍)的健脾益肠散浓缩药液。

1.6 取材

所有大鼠在最后一次给药后予以水合氯醛溶液麻醉，置冰盒上迅速打开腹腔，取出末端结肠(距离肛门10 cm长)，剪取一小段置于冻存管放入液氮中速冻，然后-80℃冰箱保存，另一小段放入4%多聚甲醛溶液中固定保存。

1.7 观察指标

1.7.1 免疫组化法检测结肠CD40的阳性表达

从4%多聚甲醛中取出结肠组织标本，依次洗涤、脱水、透明、浸蜡，包埋切片；二甲苯浸泡脱蜡，水化，抗原修复，3% H2O2阻断；一抗用CD40兔抗多克隆抗体，滴加二抗，湿盒孵育，DAB染色，苏木素复染；二甲苯透明、中性树胶封片。先在低倍镜下找到组织，并拍摄200倍图像，再选取400倍镜下阳性表达不重复的5个视野，使用图像分析系统进行CD40阳性反应产物的平均OD值分析，其值与CD40阳性表达成正比。

1.7.2 Western blot法检测结肠CD40的蛋白表达

将标本从冰箱中取出，加入裂解液提取蛋白、酶标法蛋白定量，制备下层分离胶和上层浓缩胶，每孔上样10 μg蛋白，电泳(浓缩胶80 V 40 min，分离胶 120 V 50 min)、湿转膜、5%脱脂奶粉封闭，分别加入一抗(CD40兔抗多克隆抗体) 、二抗孵育，显色后将膜置于化学发光系统中检测，以目的条带和GAPDH条带的灰度比值作为CD40蛋白的表达水平。

1.7.3 RT-PCR法检测结肠CD40的mRNA表达

将标本从冰箱中取出，根据RT-PCR的SOP依次进行组织总RNA的提取、cDNA 第一条链的合成和PCR扩增。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。CD40-F：ATGGAGATGGCCACTGAGAC，CD40-R：CCGGGACTTTAAACCACAGA，扩增片段大小180 bp；GAPDH-F：CAAGTTCAACGGCACAG，GAPDH-R：CCAGTAGACTCCACGACAT，扩增片段大小138 bp。每个样本CD40基因与GAPDH基因的相对表达量采用仪器自带软件分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 健脾益肠散对结肠组织CD40阳性表达的影响

CD40蛋白阳性表达主要分布于结肠黏膜细胞的胞膜和胞浆，呈棕黄色颗粒染色。模型组CD40的阳性表达较空白组显著增多(P<0.01)；各给药组均可不同程度地降低CD40的表达(P<0.05或P<0.01)；且健脾益肠散高剂量组优于其他给药组(P<0.05)，而其中、低剂量组与西药组比较差异不显著(P>0.05)。结果见表1、图1。

表1 各组结肠CD40阳性表达比较

注：与空白组比较，#P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，▲P<0.01；与高剂量组比较，＊P<0.05

图1 各组结肠CD40的阳性表达(DAB染色， 200×)

2.2 健脾益肠散对结肠组织CD40蛋白相对表达量的影响

与空白组比较，模型组CD40蛋白表达显著增多(P<0.01)；与模型组比较，各给药组均可减少CD40的蛋白表达(P<0.05或P<0.01)，且以中药高剂量组作用最优(P<0.01)，而其低剂量组不及西药组(P<0.05)，但中剂量组与西药组比较差异无显著性(P>0.05)。结果见表2、图2。

表2 各组结肠CD40蛋白相对表达量比较

注：与空白组比较，#P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，▲P<0.01；与高剂量组比较，★P<0.01；与西药组比较，＊P<0.05

图2 各组结肠CD40蛋白免疫印迹电泳图

2.3 健脾益肠散对结肠组织CD40 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组CD40 mRNA表达明显升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组均能降低CD40的mRNA表达(P<0.05或P<0.01)，且健脾益肠散高剂量组优于其低剂量组和西药组(P<0.05)，而中、低剂量组与西药组比较差异不显著(P>0.05)。结果见表3。

表3 各组结肠CD40 mRNA表达比较

注：与空白组比较，#P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，▲P<0.01；与高剂量组比较，＊P<0.05

3 讨论

机体正常的免疫应答是一个复杂的、多种成分参与的生理过程, 树突状细胞(DC)作为目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，其功能状态在肠黏膜 T 细胞功能性亚群分化和免疫耐受维持过程中起关键作用。DC激活是导致UC发生发展的关键启动子，而DC功能紊乱是UC发病的主要原因[4]。DC的活化有赖CD40与其配体(CD40L)的结合, 从而对不同时相的细胞免疫应答起重要控制作用。未成熟的小鼠髓系DC低表达CD40分子，而经LPS刺激成熟的DC高表达 CD40分子，诱导抗原提呈功能亢进，引起炎症因子释放，进而加重肠黏膜炎症和免疫反应，从而导致UC反复发作[5]。

研究发现，CD40在UC患者结肠黏膜组织中的阳性表达明显增加，且随病情的严重程度而升高[6]。UC大鼠存在CD40-CD40L的表达异常与免疫功能紊乱关系密切[7]。UC模型小鼠外周血细胞 CD40 分子表达较正常小鼠明显偏高，四神丸有效缓解其结肠损伤与调节外周血CD40/CD40L信号有关[8]；清肠化湿方治疗UC的作用与有效降低 DC表面抗原 CD40共刺激分子的表达相关[5]；雷公藤多苷则与调节CD40/CD40L表达水平，抑制促炎因子、升高抗炎因子以缓解UC结肠黏膜损伤相关[9]。此外，Jiang X等[10]研究表明，丹酚酸B镁治疗结肠炎的作用也与调节CD40的表达有关；丹参多酚酸盐可通过抑制CD40/CD40炎症通路达到治疗实验性结肠炎的作用[11]。因此，CD40分子的表达异常在炎症性肠病的发病中起重要作用。

UC可归属于中医“泄泻”“痢疾”等的范畴[12]。董教授认为其总属本虚标实之证，以气滞、湿热、血瘀为标，以脾气亏虚为本。若饮食失节，脾胃不顾，则脾气虚弱，气虚无以御邪，邪荡肠间，终致气滞、湿热、血瘀诸邪杂合，蚀膜溃肠化脓为疡。病程日久，则更易伤及先天肾元而病缠绵难愈[13-14]。所以治疗宜扶正祛邪、标本同治。健脾益肠散君用黄芪,臣用太子参、焦白术重在健脾益气，助卫御邪，平衡免疫；臣用白豆蔻化湿行气，木香健脾行气止痛，败酱草清热消痈、活血行瘀；佐以茯苓健脾渗湿，芡实、补骨脂补肾壮脾；使以甘草补脾益气，缓急止痛，调和诸药[15]。课题组前期研究证实,该方发挥疗效的作用机制与调控TLR4/MyD88/NF-κB信号途径指标、纠正UC异常的免疫炎症反应相关。课题组最新研究表明，健脾益肠散还可能通过调节 HSP70、ICAM-1的表达而达到对UC大鼠肠黏膜的免疫保护[16-17]。

本研究结果显示， UC模型大鼠结肠组织CD40的蛋白和mRNA 表达均较正常大鼠明显增加，与文献报道一致。健脾益肠散高、中、低剂量均可不同程度的降低UC大鼠结肠黏膜的CD40蛋白和mRNA表达，且以高剂量效果最为显著，并优于西药柳氮磺吡啶，但其中剂量与西药比较差异不显著。以上结果表明，健脾益肠散可下调TNBS诱导的UC模型大鼠结肠中CD40的表达，且药物剂量与其作用之间存在一定的量效关系。由此本研究进一步明确了健脾益肠散可能通过调节CD40分子水平，降低CD40的蛋白和mRNA表达，起到调节机体免疫应答，进而减轻结肠黏膜免疫损伤来发挥治疗UC的作用。