基于分子对接技术研究黄连解毒汤治疗糖尿病 的物质基础
2018-09-20苏虹霞段玉红
苏虹霞，段玉红
(陕西中医药大学第一附属医院，陕西 咸阳 712000)
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，由于胰岛素作用障碍或者胰岛素分泌缺陷导致持续高血糖，造成全身组织器官受到损伤，尤其是眼、肾、心血管及神经系统的损害及其功能障碍和衰竭，严重者可并发酮症酸中毒和高渗昏迷。目前，降糖西药种类比较多，Ⅰ型糖和Ⅱ型糖降糖药主要控制血糖，其作用强、起效快，但缺乏整体的协调性和安全性，产生诸多的副作用及并发症。中药具有副作用少、毒性小、疗效稳定、作用温和等诸多优点，尤其在防治糖尿病、炎症、肿瘤等疾病方面，有西药不能替代的综合优势[1-2]。中药发挥临床疗效，最主要的是多个小分子药物通过与生物体靶蛋白结合，发挥协同作用影响其生物学过程而起到治疗作用。中药的有效成分经过提取分离，从分子水平(蛋白、基因)探讨其药理作用的过程比较复杂。随着科学水平的提高，分子对接迅速发展，在中医药中广泛应用。分子对接将中药、中药复方、天然产物等小分子与疾病的关键靶点(蛋白)进行几何匹配和能量匹配。查找空间和能量与之最佳契合的生物大分子，是快速的发现药物作用潜在靶标的新方法。目前，被广泛到应用中医药领域中。
黄连解毒汤是中古代清热解毒非常经典的方剂，本方由寒性中药(黄连、黄芩、黄柏)及栀子四味中药组成，配伍剂量为3∶2∶2∶3。主要化学成分包括环烯醚萜类、挥发油类、三萜、脂肪酸类、黄酮类、生物碱类等，临床应用十分广泛。药理作用主要集中在降血糖、降血脂、降血压、抗肿瘤、抗炎、抑制肝损害等作用，目前，研究者的不断研究并结合临床指导，黄连解毒汤的药理作用和临床应用取得诸多新的进展[3-4]。通过实验证明黄连解毒汤有很好的降糖作用[5]，但是其降糖化学成分及靶标蛋白并不明确，因此对其化学成分进一步的研究，基于分子模拟技术及黄连解毒汤降糖机理的研究现状，筛选出降糖通路相关的6个靶标蛋白，尝试从整体层面，运用分子对接技术结合网络药理学方法，阐释中药功能描述与现代药理之间的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 配体库的构建
本研究依据化学专业数据库(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm)和TCMSP[6](http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)数据库的收录情况挖掘黄连解毒汤中的化学成分。化学专业数据库是中科院上海有机化学研究所承担建设的综合科技信息数据库的重要组成部分，可以提供化合物有关的命名、结构、毒性、基本性质、化学反应、天然产物、相关文献等信息。TCMSP(中药系统药理学数据库和分析平台)该软件将药动学、药效学、组学等进行系统分析，构建一个完整系统模型，为开展药效学的预测、中药药理学和验证研究提供平台。同时也为靶点发现、新药开发等提供新的研究方法。参照口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥50%，类药性(DL)≥0.18两个条件，筛选同时符合两个条件的化合物。阳性药通过Drug Bank[7](https://www.drugbank.ca/about)进行查找，选择已经上市的药为阳性药。DrugBank数据库属“生物信息学+化学信息学”类资源，涵盖了化学数据、药物数据、药理数据的详细药物数据，同时也包括药物靶点信息。所有的化合物采用Chem Office、Open Babel-2.4.1等构建成三维结构，并对其加氢、加电荷，保存为mol2格式，作为虚拟筛选的配体库[8]。
1.1.2 受体选择
结合已有的临床药理实验，选取了糖尿病发病机制各个环节中最关键和重要的靶点作为研究对象[9-10]，通过近10年文献查找糖尿病相关受体过氧化酶活化增殖受体γ(PPARγ)、二肽基肽酶(DPP-IV)、蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)、醛糖还原酶、α-葡萄糖苷酶和糖原合酶激酶-3(GSK-3)[11-13]。从蛋白质晶体结构数据库(http://www.rcsb.org/pdb)得到3D晶体结构，蛋白名称、生物学效应及原配等相关信息。PDB是药物综合数据库和药品基础研发的信息的平台。该数据库由中国医药工业信息中心开发，是国内覆盖面最广、信息量最大、应用最方便的医药行业数据库。详见表1。
表1 靶标蛋白的基本信息
1.2 iGEMDOCK虚拟筛选
iGEMDOCK[14]是一个开源的分子对接软件，操作简单易用，对接准确度比较高，主要用于初筛和精度对接等。分子对接是将化合物分子放入受体蛋白配体结合位点，通过研究受体结构特征及其与化合物分子之间作用力，依据让两者在几何、能量上匹配的原则而相互识别，筛选出结合能量最低的分子。采用iGEMDOCK(GA parameters:Popula-tion size=200，Generation=70，Number of solution=2，Binding site radius=8)对化合物分子和受体蛋白的结合腔穴进行对接。蛋白质上基团通过范德华力、氢键和静电作用与化合物分子结合，匹配出能力最低的结合位点。能量函数根据对分子对接结果的范德华力、氢键和静电作用统计，并将能量转换成单位kcal/mol。
1.3 构建多成分-蛋白靶点网络模型
采用Cytoscape2.8.1[15]软件建立多成分-多蛋白靶点网络模型，Cytoscape源自系统生物学，用于将生物分子交互网络与高通量基因表达数据和其他的分子状态信息整合在一起。其最强大的功能在于大规模蛋白质与蛋白质相互作用,蛋白质-DNA或遗传分子交互作用的分析。我们筛选出6个靶标蛋白，采用Cytoscape2.8.1中的网络互作分析，从而得到不同数据库的网络图。网络包括活性成分、蛋白2类节点(node)。若某一靶点为某化合物的潜在作用靶点，则以边(edge)相连。在此基础上，通过网络分析，研究黄连解毒汤的多靶点作用及其类方潜在治疗作用的各异性。
2 实验结果
2.1 黄连解毒汤化学成分
参照OB(≥50%)和类药性(DL)≥0.18两个条件，同时得到符合条件的化合物有22个，删除黄柏和黄芩2个相同的化学成分，确定黄连解毒汤的主要化学成分19个。其有良好的类药性和口服利用度。详见表2。
表2 通过OB和DL预测的19个候选化合物信息
2.2 分子对接评分
iGEMDOCK软件是可视化的药物设计工具。在进行构象搜索的过程中，该软件主要采用经验打分函数。其结果以能量的高低去判断与化合物结合程度，一般化合物分子与受体结合的构象稳定时能量比较低，发生的作用可能性大[14]。将黄连解毒汤中19个化学成分与糖尿病中的6个靶标蛋白进行分子对接虚拟筛选，结果见表3～4。通过分子对接研究，6个靶标蛋白质与黄连解毒汤中的19个化学成分有较好的结合作用，而且多数分子与受体结合的构象比阳性对照物结合的构象要稳定。同时这些化学成分与多个靶标蛋白质也都有较好的相互作用，进一步明确黄连解毒汤降糖的作用机制具有多途径、多靶点。
表3 黄连解毒汤中化合物与受体PPARγ、DPP-IV、PTP1B对接结果(kcal/mol)
表4 黄连解毒汤中化合物与受体醛糖还原酶、α-葡萄糖苷酶、GSK-3对接结果(kcal/mol)
续表4
2.3 黄连解毒汤多成分-多蛋白靶点网络模型
黄连解毒汤中19个化学成分，与降糖6个靶标蛋白进行能量匹配，发现PPARγ、PTP1B、醛糖还原酶、α-葡萄糖苷酶、GSK-35个蛋白是黄连解毒汤发挥降糖的主要分子机制。黄连解毒汤中9个以上的化学成分(SudanIII，3-Methylkempferol，Fumarine，(S)-Canadine，Moupinamide，Panicolin，NEOBAICALEIN等)同时调节这5个靶标蛋白，共同发挥降糖作用。而黄连解毒汤中19个化学成分和靶标蛋白DPP-IV结合的只有3个化学成分，明确DPP-IV可能不是黄连解毒汤发挥降糖的靶标蛋白。详见图1。该网络包括活性成分和靶点2类节点。
图1 黄连解毒汤多成分-蛋白靶点网络模型注：黄色-靶标蛋白，蓝色-化学成分
3 讨论
黄连解毒汤是经典的清热解毒的方剂，临床使用广泛，随着系统生物学及网络药理学等相关技术的发展，对黄连解毒汤治病机制的研究越来越深入。通过分子对接发现黄连解毒汤中9个重要的化学成分，能同时与5个靶标蛋白(PPARγ、α-葡萄糖苷酶、PTP1B、醛糖还原酶、GSK-3)结合，发挥降糖作用。研究表明，人体内糖尿病网络存在着复杂的动态调控机制，多种因子、细胞因子参与调控，但是糖尿病相关受体发挥各自的的降糖作用。相互通过协同作用调节机体平衡，靶标蛋白通过蛋白相互作用，关联在一起，从而达到降低血糖的效果。中药复方具有多成分，每个成分发挥的药效不一致，调节的靶标蛋白也具有多样性，这就导致复方的分子机制的复杂性。因为除了具有成分的多靶点作用，还有靶标蛋白的多靶点作用[15-17]。如果采用动物实验进行筛选，将付出大量的人力和时间。目前，分子微观阐释阶段的分子、药理机制结合已成为中药现代化研究的重要突破口。本实验确定了黄连解毒汤中降糖的主要活性成分以及其主要的作用靶标，这有助于阐释黄连解毒汤降糖的分子作用机制，明确临床定位和提高临床有效性及安全性评价与合理用药，并为中药复方提供一个新的研究策略，使用计算机从复杂体系中虚拟筛选出活性成分的方法简单、时间短，从而降低研究费用，提高研究效率。
