TGF-β2 TβRⅡ及Smad4在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达

蔡平福 李俊⋆ 俞颂平

白内障形成的过程中，晶状体上皮细胞发生了一系列退行性及增殖性改变。研究表明，不同类型的白内障所发生的机制不同。在此过程中，生长因子，尤其是转化生长因子β2（TGF-β2）起重要作用。Smad4是肿瘤抑制基因DPC4产物，是不同TGF-β超家族成员信号传递必需的核心分子［1］。近年来，国外一些学者已经对TGF-β/ Smad4信号通路在年龄相关性白内障中的作用展开了研究［2-3］。作者应用免疫组化的方法检测TGF-β2、TβRⅡ及Smad4在核性白内障及皮质性白内障晶状体上皮细胞中的表达，探讨其发病机制，拟为年龄相关性白内障预防与治疗提供新的思路。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2015年1月至2016年12月本院收治年龄相关性白内障患者80例为观察组，其中皮质性白内障32例（40眼），核型27例（40眼）。排除未熟期及过熟期白内障，并排除全身性疾病引起的白内障。所有对象均由同一位具有丰富超声乳化手术经验的医师在手术显微镜下完成，术中取晶状体前囊膜。所有标本用平衡盐液洗去其表面粘弹剂，予以 4%多聚甲醛溶液中固定、脱水、透明、包埋并制成蜡块，连续切片，厚度约3μm。本项目经本院伦理委员会批注，患者知情并签署知情同意书。

1.2 方法 采用免疫组化二步法检测 TGF-β2、TβRⅡ及 Smad4 的表达，鼠抗人TGF-β2单克隆抗体，兔抗人Smad4多克隆抗体，兔抗人TβRⅡ多克隆抗体，SABC试剂盒及即用型链霉亲和素—生物素—过氧化物酶免疫组化染色超敏试剂盒均购自于武汉博士德生物工程有限公司，DAB显色剂购自于福州迈新生物技术有限公司，多聚赖氨酸处理过的载玻片购自于美国Sigma公司。

1.3 判断标准 DAB显色后，TGF-β2、TβRⅡ阳性细胞的着色部位在晶状体上皮细胞的胞浆，呈棕黄色或棕褐色，胞核呈阴性。Smad4阳性细胞的着色部位在晶状体上皮细胞的胞浆，呈棕黄色或棕褐色颗粒或团块，胞核呈阴性。采用 olympus成像系统及 Image-Pro Plus 图像分析软件作TGF-β2、TβRⅡ及Smad4蛋白表达的半定量分析。随机观察10个高倍镜下视野，镜下视野清晰，无坏死、出血，计算阳性百分率，以100个细胞中所含阳性细胞个数进行统计。

1.4 统计学分析 采用SPSS18.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两组比较用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 SNK-q检验，采用 Spearman 检验进行相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织切片观察 核性白内障组晶状体上皮细胞密度明显比皮质性白内障组高。见图1。

图1 晶状体上皮组织切片

2.2 免疫组化检测晶状体上皮细胞TGF-β2、TβRⅡ和Smad4的表达 见表1。

表1 两组白内障患者晶状体上皮细胞中TGF-β2、TβRⅡ和Smad4阳性表达的比较［﹪，（±s）］

表1 两组白内障患者晶状体上皮细胞中TGF-β2、TβRⅡ和Smad4阳性表达的比较［﹪，（±s）］

TGF-β2 TβRⅡ Smad4皮质性白内障组 46.32±5.47 51.77±6.98 60.34±10.15核性白内障组 27.21±3.36 35.86±7.52 11.33±1.17 t值 18.8272 9.8072 30.3377 P值 0.0000 0.0000 0.0000

2.3 TGF-β2和smad4的相关性 经直线相关分析表明，TGF-β2与smad4的表达水平呈正相关性（r1=0.673，P1＜0.05 ；r2=0.689，P2＜0.05）。见图 2、3。

图2 皮质性白内障组Smad4与TGFβ2阳性表达散点图

图3 核性白内障组Smad4与TGFβ2阳性表达散点图

3 讨论

年龄相关性白内障包括皮质性、核性、囊下性3种，其中皮质性白内障与核性白内障在病程、疾病的发生、发展及临床表现上有明显的不同，并在组织学上有较大差异。提示这两种类型的白内障在发病机制上存在不同。年龄相关性白内障发生的过程中最早发生的是晶状体上皮的损害，即晶状体囊下上皮细胞发生多种退行性及增殖性改变。而晶状体本身为一无血液供应的器官，其增殖、分化和凋亡是由晶状体上皮细胞分泌的细胞外基质和细胞因子调控的［4］。TGF-β是一种多功能的细胞分裂调节剂，其中TGF-β2主要存在于眼内，其它组织中几乎不含TGF-β2。研究表明，人眼内TGF-β2通过抑制晶状体上皮细胞增殖而导致晶状体的混浊［5-6］。

DPC4基因位于人染色体18q21，具有2860bp转录单位，11个外显子，其产物Smad4与其它Smads相互作用构成TGF-β信号传导通路中必需的中心环节，亦在TGF-β的生长抑制作用中担当重要角色［1］。

本资料显示，晶状体组织切片可以清楚观察到核性白内障组晶状体上皮细胞密度明显比皮质性白内障组高。柳夏林［7-8］等通过探讨晶状体上皮细胞密度的改变与不同类型年龄相关性白内障的关系中发现核性白内障的晶状体上皮密度高于同年龄组其它类型白内障及对照组透明晶状体上皮细胞的密度。本资料显示，在皮质性白内障中TGF-β2、TβRⅡ的阳性表达均比核性白内障组高，差异有统计学意义。以往研究表明，晶状体上皮细胞中增殖细胞核抗原在核型白内障中的表达高于皮质性白内障。作者认为，核性白内障晶体上皮细胞中TGFβ2及TβRⅡ表达较低，对晶体上皮细胞增殖的抑制作用较弱，晶状体上皮细胞增殖较为活跃。而皮质性白内障较高的TGFβ2及TβRⅡ诱导晶体上皮细胞发生凋亡，进而导致晶状体水、电解质平衡及营养代谢的障碍，促使晶状体发生混浊，白内障发生［9］。本资料结果表明皮质性白内障中Smad4的阳性表达比核性白内障组高，且Smad4与TGFβ2的表达水平呈正相关。进一步证实Smad4是TGF-β信号细胞内传导的枢纽，协同TGFβ2及TβRⅡ抑制晶体上皮细胞增殖，从而诱导其发生凋亡，导致皮质性白内障的发生。

总之，TβRⅡ和smad4参与TGF-β2对晶状体上皮细胞生长的负性调控，提示Smad4与晶状体上皮细胞代谢、增殖、转化有关，有助于进一步了解年龄相关性白内障发生的机制，为其预防与治疗提供新的思路。