重庆地区蚕豆叶部链格孢菌的鉴定及其生物学特性研究

2018-09-19马连杰冯牧野卢文才廖敦秀

安徽农业科学 2018年26期

马连杰，张慧，冯牧野，卢文才，廖敦秀

(重庆市农业科学院农业资源与环境研究所，重庆 401329)

链格孢菌(Alternariaspp.)属子囊菌Ascomycota座囊菌纲Dothideomycetes格孢腔菌目Pleosporales格孢腔菌科Pleosporaceae链格孢属Alternaria[1],是一类适应性强、极为常见的真菌，美国农业部真菌寄主索引(USDA Fungal Host Index)中，记录了4 000多种Alternarial /Host的关系，依据寄主的数目，链格孢属位于近2 000种真菌属中的第10位[2]。全世界已描述的约500个链格孢种级分类单位中，95%以上兼性寄生在植物上，引起多种经济植物病害[3]，如马铃薯早疫病、梨黑斑病、烟草赤星病(褐斑病)等。链格孢真菌属级特征明显，但种级特征变异较大，易于鉴定到属但难于鉴定到种，特别是利用小孢子形态鉴定到种更加困难，因为在人工培养基上培养易受环境影响出现趋同现象[4-5]。研究表明，利用接近自然状态、营养相对贫乏的马铃薯-胡萝卜-琼脂( potato carrot agar，PCA) 人工培养基，加上光/暗交替等培养条件，能够根据菌落特征、产孢表型及分生孢子形态等综合鉴定不同小孢子种在形态上的差异[6]。近年来随着分子生物学的发展，DNA分子标记技术和DNA序列分析技术逐渐应用于链格孢属真菌的分类鉴定及系统发育研究中。Hong等[7]将IGS-RFLP分析用于链格孢的分类研究，用11种限制性内切酶对5个链格孢种进行IGS-RFLP分析，结果可以将大孢子链格孢和小孢子链格孢明确区分开。王洪凯等[5]、Adachi等[8]利用ITS序列，Peever等[9]、岳海梅等[10]利用endoPG基因序列，曲文文等[11]在利用endoPG序列的基础上结合OPA2-1、OPA1-3随机区段序列对链格孢的系统发育进行了研究，严进等[12]利用ITS及gpd序列对河北和山东鸭梨果实上链格孢菌进行了鉴定。

目前国内外针对蚕豆链格孢病害的研究较少，重庆地区更无此类研究。为此，笔者对分离自蚕豆叶部病斑上的2株具有典型孢子形态特征的链格孢属真菌DJHB-2和DJHB-3开展形态学观察、系统发育分析和生物学特性研究，以期为重庆蚕豆链格孢病害研究提供参考。

1 材料与方法

1.1试验材料病原分离材料于2017年3—4月采自重庆市农业科学院特色作物所永川区实验基地和垫江县沙坪镇实验基地蚕豆大面积种植区，从蚕豆叶病部组织分离到链格孢菌株16株，选取其中孢子形态不同、具有典型特征的代表性菌株2株(DJHB-2和DJHB-3)展开研究。

1.2试验方法

1.2.1病原菌形态鉴定。将菌株接种于PDA培养基中，28 ℃下培养，7 d后观察菌落颜色、形状。将长满菌丝的菌饼接种至PCA产孢培养基上，待产生孢子后，在40倍显微镜下观察产孢结构及分生孢子形态。

1.2.2病原菌的分子鉴定。用CTAB法提取基因组DNA，采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)；ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′)；EF1-986R(5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′)2对引物进行PCR扩增，引物合成及测序由北京六合华大基因科技有限公司完成。50 μL PCR扩增体系：2×TaqMasterMix 25 μL、10 μmol/L上下游引物各l μL、DNA模板2 μL，ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件(ITS)：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应条件(EF1)：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。采用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，PCR产物直接送至测序公司测序，所得序列在GenBank中进行同源性比对，用MEGA6.0软件以邻接法构建系统发育树。

1.2.3菌株致病性测定。采用离体叶片接种法进行致病性测定。选取纯化菌株DJHB-2和DJHB-3在PDA平板上培养活化，待菌丝铺满培养皿后，用灭菌的打孔器取1 cm菌饼备用。蚕豆叶片经0.5%次氯酸钠消毒后，晾干，取无菌培养皿，铺上以无菌水浸湿的滤纸，将菌饼接种至蚕豆叶片上，同时以无菌PDA培养基圆片为对照。置于25 ℃恒温培养4 d后，观察发病情况。

1.2.4温度对菌丝生长的影响。将菌饼(直径1 cm)接种于PDA培养基上，分别置于5、10、15、20、25、28、30、35 ℃共8种温度条件下培养，每个处理重复6次，7 d后用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.5pH对菌丝生长的影响。用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH将PDA培养基的pH调配为2～11(每1为一个梯度)，接入菌饼，28 ℃恒温培养，每个处理重复6次，7 d后用十字交叉法测量菌落直径。

1.3数据分析数据分析及制图采用Excel 2010和SPSS 22.0，利用单因素方差分析法分析各组数据差异显著性。

2 结果与分析

2.1病原菌的培养性状和菌落形态菌株DJHB-2，平板菌落呈棉絮状，初期白色，后期发展为橄榄色或墨绿色，菌落边缘白色，通常不产生扩散色素。培养7～10 d后菌落直径达70 mm以上。在PCA平板上，20～25 ℃下培养5～7 d后，可产生5～12个孢子组成的孢子链，分子链多有分枝。分生孢子卵形、阔倒棒状、倒梨形或近椭圆形，具3～8个横隔膜和0～3个斜纵隔膜，分隔处略溢缩，短喙柱状或锥状，黄褐色(图A～B)，同时参照张天宇[4]的方法初步鉴定为链格孢菌A.alternata。

菌株DJHB-3在PDA平板上呈羊毛状，菌落浅橄榄或灰橄榄色，菌落边缘白色，不产生扩散色素。培养7～10 d后菌落直径50～70 mm。在PCA平板上，20～25 ℃培养5～7 d，可产生6～12个分生孢子组成的孢子链，孢子链不分枝或罕见分枝。分生孢子卵形，阔倒棒状，褐色，具1～4个横隔膜，1～3个纵斜隔膜，分隔外略溢缩，大多分生孢子具短喙(图C～D)，同时参照张天宇[4]的方法初步鉴定为细极链格孢菌A.tenuissima。

2.2DNA系统发育分析

2.2.1基于ITS序列的系统发育。链格孢菌株DJHB-2和DJHB-3的ITS序列约540 bp。由图2可知，DJHB-2与Alternariaalternata(KT192214.1)聚在一起，DJHB-3与其他链格孢种聚在一起。

2.2.2基于EF-1α序列的系统发育。链格孢菌株DJHB-2和DJHB-3的ITS序列约250 bp。由图3可知，待测菌株EF-1α基因序列与Alternariatenuissima(LC136865.1)、Alternariaalternata(LC132712.1)和Alternariagaisen(KC584667.1)聚在同一个分支上，可见EF-1α基因序列在种的区分上不强。

注:A.DJHB-2菌株在PDA培养基28 ℃培养7 d后的菌落；B.DJHB-2菌株在PCA培养基25 ℃培养7 d后在40倍显微镜下观测的菌株分生孢子；C.DJHB-3在PDA培养基28 ℃培养7 d后的菌落，D: DJHB-3在PCA培养基上25 ℃培养7 d后的分生孢子Note:A.Colony of DJHB-2 on PDA after 7 days at 28 ℃;B.Conidia of DJHB-2 on PCA after 7 days at 28 ℃;C.Colony of DJHB-3 on PDA after 7 days at 28 ℃;D.Conidia of DJHB-3 on PCA after 7 days at 28 ℃图1 DJHB-2和DJHB-3平板菌落和孢子形态特征Fig.1 Morphological characteristics of colonies and spores of DJHB-2 and DJHB-3 on plates

图2 基于ITS序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS sequence

2.3致病性鉴定室内叶部离体接种链格孢菌株DJHB-2和DJHB-3的结果见图4。由图4可知DJHB-2和DJHB-3 2株链格孢菌株均能引起蚕豆叶部病害，病斑呈不规则黑色。DJHB-2病斑大且更明显。

2.4生物学特性分析

2.4.1不同温度对病原菌菌丝生长的影响。由图5可知，温度对此2株菌菌丝生长有明显的影响，在不同温度下DJHB -2 和DJHB-3 2种病原菌菌丝生长随温度变化趋势基本相同，菌株在5～35 ℃均能生长，适宜菌丝生长的温度为25～30 ℃，最适菌丝生长温度为28 ℃，在5～25 ℃菌落直径随温度升高而升高，尤其在20～28 ℃，菌落生长迅速，28 ℃达到最大，之后随温度升高而升高，35 ℃后菌落生长均受到抑制。

图3 基于EF-1α构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on EF-1α sequence

注：A.DJHB-2侵染蚕豆离体叶片；B.对照；C.DJHB-3侵染蚕豆离体叶片Note:A.Isolated Vicia fabu leaves infected by DJHB-2;B.CK;C.Isolated Vicia fabu leaves infected by DJHB-3图4 菌株DJHB-2和DJHB-3在蚕豆离体叶片上致病性鉴定Fig.4 Pathogenicity of strains DJHB-2 and DJHB-3 on isolated leaves of Vicia faba

图5 不同温度对病原菌菌丝生长的影响Fig.5 Effects of different temperatures on mycelial growth

2.4.2不同pH对病原菌菌丝生长的影响。由图6可知，2个菌株在pH为2～11时均能正常生长，pH对菌株DJHB-2和DJHB-3菌丝生长无明显影响。适宜菌丝生长的pH为7～10。

3 结论与讨论

重庆地区地处四川盆地东南缘，四面临山，冬季寡照，多雨多雾，是我国冬季日照时间最短的地区[13]。这种特殊的生态条件使蚕豆成为重庆市重要的冷季作物，其种植面积仅次于油菜，在重庆市种植业结构调整中起着重要作用。综合孢子形态和分子鉴定结果，该试验将蚕豆叶片上2株具有典型孢子形态的链格孢菌株鉴定为链格孢菌(DJHB-2)和细极链格孢菌(DJHB-3)2个种。从系统发育结果看，ITS序列对这2个菌种有一定的区分性，EF-1α序列对这2个菌株区分性不佳。2株菌对温度较敏感，最适温度为28 ℃，pH适应性强，在pH 2～11时均能生长。但该试验还有一定不足，未对采集到的全部链格孢菌株进行测序分析。后续试验在条件允许情况下将增加采样点，加大样本量，对重庆地区蚕豆链格孢菌株在种上进行系统分析，为蚕豆链格孢病害防治提供参考。