低能离子注入对丛枝菌根真菌及其与蒺藜苜蓿共生的影响

陈 浩，石 磊，解继红，宋智青

(1.内蒙古工业大学，内蒙古呼和浩特010051；2.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特 010110；3.中国农业科学院草原研究所，内蒙古呼和浩特 010010)

20世纪80年代中期，余增亮研究员带领的研究组首先将低能离子注入技术应用于农作物的诱变育种，发现低能离子注入作为一种新的生物诱变源具有损伤轻、突变率高、突变谱广的特点。该技术关联度高、影响面广，用于农作物和微生物育种取得一系列成果，是一种行之有效的诱变方法[1-4]。与此同时，低能离子注入的当代刺激效应也能够促进微生物和植物生长，这些作用对于物种的改良都十分重要。然而，关于低能离子注入对植物根部微生物影响的研究很少，限制它的应用。

丛枝菌根真菌(ArbuscularMycorrhizalfungi，AMF)是一种专性共生真菌，而丛枝菌根(ArbuscularMycorrhiza，AM)是由丛枝菌根真菌与植物形成的共生联合体，是地球上分布最广泛的共生体。丛枝菌根真菌能够侵染包括豆科牧草在内的80%的陆生植物，它能够从土壤中吸收矿质元素，如N、P等，并传输给植物促进其生长，同时也从植物体中吸收碳水化合物和脂类[5-8]。但是，当丛枝菌根共生体暴露在土壤中时，土壤环境中的负面因素(如盐碱、干旱、低温、污染物等)对其孢子的萌发、菌群落的变化、繁殖也有一定的影响，必然会影响丛枝菌根的形成及功能，进而影响丛枝菌根的接种效果。如果能将低能离子束生物技术应用于丛枝菌根真菌的品质改良，则可望提高丛枝菌根真菌利用的效果。蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)因与其他重要作物如大豆、紫花苜蓿亲缘关系很近，而且具有其他豆科植物所不具有的遗传特性而被人们选择为研究豆科的模式植物[9]。同时，蒺藜苜蓿可以和丛枝菌根真菌形成良好的共生关系。因此，蒺藜苜蓿是用来研究丛枝菌根共生的优良材料。

选定豆科模式植物——蒺藜苜蓿为宿主，以光自养培养体系共生培养，研究低能离子注入对丛枝菌根真菌生长及其与蒺藜苜蓿共生的影响，探讨提高蒺藜苜蓿-丛枝菌根共生体系在逆境生存力的方法，为提高豆科牧草抗逆性的研究提供新思路和新方法。

1 材料与方法

1.1供试菌种GlomusetunicatumBecker&Gerdemann由美国康奈尔大学Teresa E.Pawlowska 博士馈赠。

1.2寄主及培养基蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，ecotype Jemalong A17)由美国明尼苏达大学N.D.Young博士馈赠。蒺藜苜蓿和丛枝菌根真菌都是在MSR培养基上生长(modified Strullu-Romand medium)[10]。MSR培养基成分见表1。

1.3丛枝菌根真菌孢子的无菌提取当AMF新生孢子成熟后，将含有孢子的培养基放入无菌锥形瓶中，加入10倍体积无菌的10 mmol/L柠檬酸钠，并充分搅拌至孢子和菌丝分离。用200目尼龙网过滤得到孢子，以去除残留的柠檬酸钠，再用无菌水将孢子洗下，在解剖镜下将孢子用20 μL移液器收集到无菌的1.5 mL离心管中待用[11]。

表1MSR培养基组分

Table1ThecompositionofmodifiedStrullu-Romand(MSR)mediamg/L

组分Composition含量Content组分Composition含量ContentMgSO4·7H2O739 KCl65 KNO376KH2PO44.1Ca(NO3)2·4H2O359MnSO4·4H2O2.45ZnSO4·7H2O0.29H3BO31.86CuSO4·5H2O0.24Na2Mo O40.002 4(NH4)6Mo7O24·4H2O0.035Thiamin(VB1)1Pyridoxine(VB6)0.9Cyanocobalamine(VB12)0.4Nicotinic acid1泛酸钙0.9生物素Biotin0.9×10-3NaFe·EDTA8

注：调节pH，121℃高压蒸汽灭菌15 min

Note：Regulating pH，high pressure steam sterilization for 15 min at 121 ℃

1.4低能离子注入注入装置为低能离子注入机(IBBe-Device)。注入离子为Ar离子，剂量为0(CK1)，1.25×1015，2.50×1015，3.75×1015，5.00×1015，6.25×1015，7.50×1015ions/cm2，以真空作对照组(CK2)。能量为30 keV，脉冲注入，每个脉冲注入1.25×1015ions/cm2，脉冲之间间隔30 s，真空度为0.05 Pa。真空对照置于注入托盘上，除了没有接受离子注入外，其他条件及后续处理均与处理组一致。

1.5孢子萌发率和菌丝长度检测每个平皿中接入 80～100 个提取的Glomusetunicatum无菌孢子。用Parafilm膜封口后，于 28 ℃黑暗倒置培养 10 d。取出置于解剖镜(Motic K-700 L)下统计孢子萌发率，于显微镜(Olympus X51)下统计菌丝长度，每组处理重复3次。 相对菌丝长度计算公式如下：

相对菌丝长度(%)= 处理组孢子菌丝长度/对照组孢子菌丝长度×100%

(1)

1.6光自养培养体系和侵染率的检测光自养培养体系装置分2个部分：苗室和菌根室。菌根室中加入约40 mL MSR培养基(用0.3%Phytogel固定，不含蔗糖和维生素)。将萌发3 d的幼苗移入菌根室，并将幼苗顶端插入苗室底部与菌根室相连的孔中，然后将约20粒上述方法得到的孢子加入到幼苗根旁，用封口膜将培养皿封住。将装置放入光照培养箱中25 ℃培养，光照周期为16 h白天/8 h夜晚。

培养8周后，将根从菌根室中取出后，FAA固定液固定1 d，然后用10%KOH(W/V)溶液90 ℃消化1～2 h，除去根中的细胞质，以便于观察。将根浸入1%HCl中酸化3～5 min后用台盼蓝染色[11]，进行侵染率检测。

1.7后代孢子产量和根外菌丝长度的统计后代孢子数量在解剖镜下镜检；于显微镜(Olympus X51)下统计根外菌丝长度。相对孢子产量、相对根外菌丝长度计算公式如下：

相对孢子产量(%)= 处理组孢子产量/对照组孢子产量×100%

(2)

相对根外菌丝长度(%)=处理组根外菌丝长度/对照组根外菌丝长度×100%

(3)

1.8数据分析利用t检验进行统计学意义分析，当P<0.05 时，视作差异显著。

2 结果与分析

2.1离子注入对丛枝菌根真菌孢子萌发的影响试验结果表明，1.25×1015、2.50×1015、3.75×1015、5.00×1015、6.25×1015、7.50×1015ions/cm2剂量组孢子萌发率分别为76.7%、78.9%、70.3%、57.9%、34.3%、21.5%，CK1孢子萌发率为70.4%，CK2孢子萌发率为71.7%，各剂量组孢子萌发率与CK1差异显著。

可以看出，不同剂量的低能离子注入对丛枝菌根真菌孢子萌发率产生不同的影响。1.25×1015、2.50×1015ions/cm2剂量组显著提高孢子萌发率；5.00×1015ions/cm2及以上剂量组抑制孢子萌发，其中6.25×1015ions/cm2剂量组可将孢子萌发率降至对照组的50%左右。出于当代刺激效应和诱变效应两方面的考虑，选取2.50×1015、6.25×1015ions/cm2两剂组量进行后续研究。

2.2离子注入对丛枝菌根真菌早期菌丝生长的影响由表2可知，2.50×1015ions/cm2剂量组孢子相对菌丝长度为123.3%，显著促进了菌丝的生长，而6.25×1015ions/cm2剂量组孢子相对菌丝长度为74.1%,抑制菌丝的生长。说明不同剂量的低能离子注入会对丛枝菌根真菌早期的菌丝生长造成不同程度的影响。

表2离子注入对丛枝菌根真菌菌丝长度、真菌侵染率、相对孢子产量、相对根外菌丝长度的影响

Table2Effectofionirradiationonhyphallength，colonizationrate，relativeporeyieldandrelativeextra-radicalhyphalofArbuscularMycorrhizalfungi%

注入剂量Injected volume×1015ions/cm2孢子相对菌丝长度Hyphallength侵染率Infection rate相对孢子产量Relativepore yield相对根外菌丝长度Relativeextra-radicalhyphalCK110070.701001002.50123.3*74.30103.20106.506.2574.1*69.1094.8096.10

注：*表示与CK1差异显著

Note：* stands for significant differences with CK1

2.3离子注入对丛枝菌根真菌与蒺藜苜蓿共生的影响

2.3.1离子注入对丛枝菌根真菌侵染率的影响。丛枝菌根真菌的侵染效果是共生建立的关键因素。由表2可知，各处理组对侵染率影响均不显著。说明低能离子注入虽然影响了丛枝菌根真菌早期生长，但其与蒺藜苜蓿的共生关系仍可正常建立。

2.3.2离子注入对丛枝菌根真菌后代孢子和根外菌丝生长的影响。由表2可知，各处理组对后代孢子产量和根外菌丝的生长无显著影响。说明离子注入的丛枝菌根真菌与蒺藜苜蓿建立共生关系后，仍可正常的完成其生命周期。

3 结论与讨论

目前，低能离子注入对丛枝菌根真菌影响的研究极少。该研究结果表明，不同剂量的Ar离子注入对丛枝菌根真菌孢子萌发率产生不同的影响：1.25×1015、2.50×1015ions/cm2剂量组显著提高孢子萌发率；5.00×1015ions/cm2及以上剂量组抑制孢子萌发，其中6.25×1015ions/cm2剂量处理可将孢子萌发率降至对照组的50%左右。出于利用当代刺激效应和诱变效应两方面的考虑，选取2.50×1015、6.25×1015ions/cm2两剂量组进行后续研究。2.50×1015ions/cm2剂量组显著促进菌丝的生长，而6.25×1015ions/cm2剂量组抑制菌丝的生长。孢子萌发率和菌丝的生长是丛枝菌根真菌初期生命活力的表征，低剂量的离子注入促进这些指标上升，对于在逆境中提高丛枝菌根真菌的活力有重要意义。而高剂量的离子注入抑制丛枝菌根真菌的存活和初期的生长，说明离子注入可能会对其产生诱变效应。

由于专性共生的特点，菌根真菌对宿主植物根系的侵染是其生长发育的先决条件，而侵染率是直接反映AM真菌对宿主植物亲和性的指标。侵染率的高低会影响菌根真菌从宿主植物获取碳水化合物的能力，进而影响菌根真菌的生长发育如根外孢子萌发以及菌丝生长等。AM 真菌的根外真菌生物量直接反映后代根外真菌的生长状况，其中包括孢子和菌丝的数量。在该试验中，各处理组对后代侵染率、孢子产量和根外菌丝的生长均无显著影响。说明离子注入虽然会对AM真菌早期生长产生影响，但丛枝菌根真菌仍可完成其生命周期，菌与根的共生仍然能够建立。这种结果意味着可以在高剂量离子注入后，对丛枝菌根真菌的生长进行长期的观测和筛选，这对于丛枝菌根真菌的离子束诱变育种工作具有重大意义。