盐酸小檗碱与牛血清蛋白结合率的测定

周珍　冯慧　郝露　赵娅　周邦华　叶凡　赖先荣

【摘 要】 目的：建立牛血清中盐酸小檗碱浓度的分析方法，测定不同浓度盐酸小檗碱与牛血清蛋白结合率。方法：采用 HPLC 法，流动相乙腈（A）-0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（pH=2.8）（B）梯度洗脱（0～32 min，20%～28% A），检测波长345 nm；采用平衡透析法测定盐酸小檗碱与牛血清蛋白结合率。结果：当盐酸小檗碱浓度在10～80 μg/mL时，牛血清蛋白结合率在20%～30%之间。当盐酸小檗碱浓度在10～20 μg/mL时，牛血清蛋白结合率随着浓度升高而降低；当盐酸小檗碱浓度在20～80 μg/mL时，牛血清蛋白结合率随着浓度升高并无明显变化。结论：盐酸小檗碱与牛血清蛋白属于中等程度的蛋白结合率，且当药物浓度在10～20 μg/mL时，具有浓度依赖性。

【关键词】 盐酸小檗碱；高效液相色谱法；平衡透析法；牛血清蛋白结合率

【中图分类号】R284 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）10-0030-04

Abstract：Objective To Establish an HPLC method for the concentration of berberine hydrochloride in bovine serum and determine the protein binding rate of bovine serum protein and berberine hydrochloride at different concentrations.Methods By using HPLC method， mobile phase acetonitrile （A）-0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate （pH=2.8） （B） gradient elution （0～32 min， 20%～28% A）， the detection wavelength of 345 nm. Equilibrium dialysis method was used to investigate binding rates of berberine hydrochloride with plasma proteins.Results When the concentration of berberine hydrochloride at 10～80 μg/mL， the protein binding rate of bovine serum was between 20%～30%.When the concentration of berberine hydrochloride at 10～20 μg/mL， the binding rate of bovine serum protein decreases with the increase of concentration. When the concentration of berberine hydrochloride at 20～80 μg/mL， the protein binding rate of bovine serum was not significantly changed with the increase of concentration.Conclusion Berberine hydrochloride and bovine serum protein belonged to a moderate protein binding rate， and when the drug concentration is 10～20 μg/mL， it had a concentration dependence.

Keywords：Berberine Hydrochloride； HPLC； Balanced Dialysis； Bovine Serum Protein Binding Rate

藥物的血清蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一，影响着药物在体内的分布、代谢和排泄，从而影响药物的作用强度和时间，与药物的相互作用及作用机制等密切相关。盐酸小檗碱（Berberine Hydrochloride）是小檗科植物甘肃小檗（Berberis kansuensis Schneid.）及其同属植物中分离得到的生物碱成分之一[1-3]，临床上用于敏感菌所致的肠道感染，口服途径给药，每次0.1～0.3 g，每日3次。药理学研究发现，盐酸小檗碱具有治疗糖尿病[4]及其并发症等作用[5-7]，对有脂肪肝的2 型糖尿病患者口服盐酸小檗碱每次0.5g，每日3次[8]。由于盐酸小檗碱口服吸收差[9]，这是否与盐酸小檗碱的蛋白结合率有关？文献采用平衡透析法、对盐酸小檗碱与血蛋白结合率及其药代动力学进行了研究[10-16]，认为盐酸小檗碱具有中等强度的蛋白结合率，但不同浓度的盐酸小檗碱与牛血清蛋白结合率研究尚未见报道，导致与之相关的生物利用度难以明确，笔者采用平衡透析法研究不同浓度的盐酸小檗碱在牛血清中的蛋白结合率。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC2030高效液相色谱仪（日本岛津公司）；BSA124S型电子天平（北京赛多利斯科学仪器公司）；CT15RT台式高速冷冻离心机（上海天美生化仪器设备工程有限公司）；pHS-3C型酸度计（成都世纪方舟科技有限公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海驰唐电子有限公司）；DZKW-4型电恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；MD34透析袋（8000-12000）（SCIENTIFIC RESEARCH SPECIAL美国）；ULUP-I-10T型超纯水机（成都超纯科技有限公司）。

1.2 材料 盐酸小檗碱对照品（批号：MUST-16111115，中国科学院成都生物研究所）；盐酸小檗碱原料药（批号：111101，成都龙泉高科天然药业有限公司）；新生牛血清（批号：20161021，浙江天杭生物科技股份有限公司）；乙腈、甲醇为色谱纯；纯净水由超纯水机制备系统制备；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠，磷酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的配置

2.1.1 空白透析液的配制 配制0.067 mol/L NaHPO4和0.067 mol/L NaH2PO4溶液；按4∶[KG-*3/5]1比例混合成1 000 mL，加入氯化钠8.776 g，并用磷酸调节其pH值为7.4，即得磷酸盐缓冲液[17]。

2.1.2 盐酸小檗碱系列溶液Ⅰ 精密称定盐酸小檗碱对照品5 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈∶[KG-*3/5]甲醇（1∶[KG-*3/5]2）定容，即得质量浓度为500 μg/mL的盐酸小檗碱溶液。

2.1.3 盐酸小檗碱系列溶液Ⅱ 取盐酸小檗碱系列溶液Ⅰ适量，置于10 mL量瓶中，加乙腈∶[KG-*3/5]甲醇（1∶[KG-*3/5]2）稀释成1、2、5、10、15、20 μg/mL的系列溶液，用于标准曲线的绘制。

2.1.4 盐酸小檗碱系列溶液Ⅲ 精密称定盐酸小檗碱原料药80.0 mg，分别置于1000 mL量瓶中，各取适量用空白透析液稀释成10、20、40、60、80 μg/mL的系列溶液，用于蛋白结合率的研究。

2.2 色谱条件 色谱柱：Swell Chromplus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾（pH=2.8）；梯度洗脱（0～32 min，20%[KG-*4]～28% A）；柱温：30℃；检测波长：345 nm；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。

2.3 透析液样品预处理 精密量取透析内液或透析外液样品0.2 mL，置10 mL具塞离心管中，加入1 mL乙腈∶[KG-*3/5]甲醇（1∶[KG-*3/5]2），涡旋混匀3 min，静置1 min，于12000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm滤头，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 分别取空白牛血清、盐酸小檗碱原料药及空白透析液，按照“2.3”项下方法处理，在“2.2”项下的色谱条件下测定，色谱图如图1所示。空白牛血清、空白透析液在此条件下对盐酸小檗碱的测定无干扰。

2.4.2 标准曲线制备 取盐酸小檗碱系列溶液Ⅱ适量，在“2.2”项下的色谱条件下测定，以峰面积为纵坐标，药物浓度浓度为横坐标，得回归方程y=39325x-7031，r=0.9993（n=6）；线性范围1～20 μg/mL。

2.4.3 精密度 在空白牛血清或空白透析液中加入盐酸小檗碱系列溶液Ⅰ，配制成低、中、高（10，40，80 μg/mL）3个质量浓度的样品，按“2.3”项下处理后进样，1 d内连续测定6次，连续测定3 d。结果见表1。

2.4.4 提取回收率 在空白牛血清或空白透析液中加入盐酸小檗碱系列溶液Ⅰ，配制成低、中、高（10，40，80 μg/mL）3个质量浓度的样品，按“2.3”项下处理后进样，计算盐酸小檗碱的透析內液提取回收率分别为（102.55±1.06）%，（101.71±1.53）%，（103.67±1.66）%，透析袋外液提取回收率分别为（102.81±2.14）%，（100.77±1.27）%，（103.09±1.08）%。

2.4.5 稳定性 在空白牛血清中加入盐酸小檗碱系列溶液Ⅰ，配制成低、中、高（10，40，80 μg/mL）3个质量浓度的样品，考察血清样品预处理后室温放置4 h和-70℃放置1周的稳定性，计算在室温下放置4 h的RSD分别为1.16%、1.54%和1.62%，-70℃放置1周的RSD分别为2.02%、2.07%和1.25%，结果表明血清样品的稳定性良好。

2.5 平衡时间的考察 在透析袋内以空白透析液代替牛血清，透析外液中盐酸小檗碱的质量浓度分别为10、40、80 μg/mL，进行平衡透析试验，分别于6、8、10 h结束试验，按“2.3”项下方法处理，按“2.2”项下色谱条件测定透析袋内、外盐酸小檗碱质量浓度，结果显示盐酸小檗碱透析达平衡时间约8 h。见表2。

2.6 透析膜物理吸附考察 透析膜物理吸附考察平衡透析试验时考察透析膜对药物的吸附作用，计算低、中、高（10、40、80 μg/mL）3个质量浓度的样品。透析膜对盐酸小檗碱的吸附率为（2.09±0.37）%，（3.45±0.28）%，（4.63±0.35）%。结果表明透析膜存在微量吸附作用，但对测定结果无显著影响，提示透析膜对药物的物理吸附作用可忽略不计。

2.7 透析袋的预处理 将透析袋剪成10 cm长度的小段，在500 mL 2%的碳酸氢钠和EDTA溶液中将透析袋煮沸10 min，用蒸馏水清洗3次，然后再在500 mL的1 mmol/L EDTA（pH8.0）溶液中煮10 min。冷卻后，用蒸馏水清洗3次，置于30%乙醇中，放于4℃冰箱备用[18]。

2.8 蛋白结合率测定 试验前先将预处理后的透析袋用蒸馏水漂洗干净，取一端用透析袋夹夹紧的透析袋，挤压除去袋内外水分，精密吸取2 mL空白牛血清加至透析袋中，夹紧袋口，悬浮于盛有45 mL含盐酸小檗碱分别10、20、40、60、80 μg/mL的透析液的烧杯中，每种浓度平行试验5份。调整透析袋位置，使透析袋内外液面应保持同一水平，并避免贴壁，密封，置于37℃水浴锅中放置8h。到达平衡透析时间后，吸出袋外透析液少许，加等量3%三氯醋酸试剂，在黑色背景下立即观察，如见浓厚的白色云雾状沉淀快速下降，而且形成较多的沉淀物，此为阳性。如袋外透析液蛋白检查阳性，则该样本作废。如无血清蛋白漏出者，分别取透析袋内外样品按照“2.3”项处理，测定袋内药物的盐酸小檗碱峰面积，再根据“2.5”项标准曲线计算平衡后袋内外药物浓度，分别记为C内、C外。根据公式（C内-C外）/ C内×100%计算血清蛋白结合率。结果见表3。

3 讨论

实验在前期色谱条件的选择时，参考2015版《中国药典》二部“盐酸小檗碱”的HPLC的检查方法，并参考相关文献，考察了乙腈-0.02 moL/L磷酸二氢钾溶液、甲醇-0.2%磷酸-0.1%三乙胺等溶液为流动相，最终确定乙腈-0.02 moL/L磷酸二氢钾溶液，并优化流动相比例进行梯度洗脱。在该条件下，透析内、外液中的内源性物质不干扰样品中的盐酸小檗碱的测定，峰形良好，保留时间为26.5min，空白血清图谱中对应基线波动小，无杂峰出现。本方法具有较高的专属性。

采用平衡透析法考察了在新生牛血清中盐酸小檗碱的浓度与蛋白结合率的关系。参照文献方法[18]，采用截留相对分子质量为8000～12000的透析膜进行实验，与空白透析液的样品相比，透析外液的样品图谱基线较平稳，无明显杂质峰，表明清中并无大量内源性物质从透析袋中渗出。此外，考察透析膜对药物的物理吸附作用，结果表明存在微量的吸附作用，对实验结果无较大影响。

实验结果表明，当药物浓度在10～80 μg/mL时，血清蛋白结合率在20%[KG-*4]～30%之间，属于中等程度的蛋白结合率。药物与血清蛋白的结合一般分为浓度依赖性和非浓度依赖性。当药物浓度在10～20 μg/mL时，血清蛋白结合率随着浓度升高而降低，具有浓度依赖性；当药物浓度在20～80 μg/mL时，血清蛋白结合率随着药物浓度升高不明显，为非浓度依赖性。在临床用药中，对于糖尿病等慢性疾病可以在保证一定血药浓度的情况下使用较低浓度的药物，使与蛋白结合的盐酸小檗碱逐渐释放以达到稳定的治疗效果。

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（收稿日期：2018-04-10 编辑：陶希睿）