三七花提取物对小鼠NK细胞活性的增强作用

王恒禹，董艳萍

(1. 云南省药物研究所，云南白药集团创新研发中心，云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111； 2. 昆药集团股份有限公司药物研究院，云南 昆明 650100)

全世界只有中国产三七，而中国三七的主产地在云南。为改变长期以来三七花、三七茎叶不能作为普通食品原料进行开发利用的现状，2016年5月13日，云南省卫生计生委正式批复同意将三七花和三七茎叶作为普通地方特色食品原料进行管理[1]。

钟媛媛等[2]研究发现不同浓度的三七多糖能够增强小鼠的淋巴细胞转化能力、提高体内抗体生成细胞数和抗体积数、提高腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数，对小鼠的细胞免疫和体液免疫均有一定的促进作用。三七总皂苷具有增强免疫力的功能，能显著提高巨噬细胞吞噬率，提高血液中淋巴细胞的百分比[3]。据测定，三七花同样也含有多糖、皂苷、黄酮、鸟苷腺苷、β-谷甾醇、胡萝卜素等成分[4]。本文通过测定三七花提取物对自然杀伤(NK)细胞活性的影响，进而研究三七花提取物的免疫调节功能以求更好地利用三七花资源。

NK细胞由造血干细胞分化发育而来，成熟的NK细胞主要分布于肝、脾和外周血中，NK细胞是具有细胞溶解作用、能够分泌免疫调节因子的效应淋巴细胞，它与T/B淋巴细胞不同，NK细胞同时具有固有免疫和适应免疫的特征，在免疫系统中具有重要作用[5]。本文通过水提、过滤、浓缩、冻干等工艺获得了三七花提取物[6]，研究了三七花水提物对小鼠NK细胞活性的影响，可为三七花在功能食品领域中的应用提供理论支持。

1 理论支撑

在正常生理状况下，细胞内的乳酸脱氢酶(LDH)不能穿过细胞膜，但当细胞受到NK细胞的杀伤而裂解后，LDH释放到细胞膜外的培养基上清中。释放出来的LDH可通过酶试剂盒检测。在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。甲臜的量与LDH的浓度亦即裂解的细胞数成正比，通过测定吸光度值可以直观地反映出上清液中的甲臜含量[7]。吸光度越高说明上清液中的甲臜含量越高，酶反应之前的LDH浓度也越高，裂解的细胞数越多，NK细胞的活性越强；相反，吸光度值越低，说明上清液中的甲臜含量较低，酶反应之前的LDH浓度也较低，裂解的细胞数越少，对应的NK细胞活性也较低。NK细胞活性的变化与吸光度的变化呈线性关系，因此可以通过检测吸光度值，通过比较试验组吸光度值与空白对照组吸光度值计算出NK细胞的相对活性。

2 实验

2.1 材料

三七花，昆明道地中药饮片厂；雌性Balb/c小鼠，18～22 g，购自上海斯莱克实验动物中心；全波长酶标仪，美国Thermo公司；96孔细胞培养板(圆底)，上海基星生物科技有限公司；无菌铝箔封板膜，北京博特森生物技术有限公司；小鼠淋巴瘤细胞(YAC-1)，上海研生实业有限公司；D-Hanks平衡盐缓冲液(HBSS)，上海研卉生物科技有限公司；RPMI 1640完全培养液，上海杰美基因医药科技有限公司；重组人白细胞介素-2(rhIL-2)，广州市博理生物科技有限公司；CytoTox 96®非放射性细胞毒性检测试剂盒，普洛麦格(北京)生物技术有限公司；Gey’s红细胞裂解液，北京百奥莱博科技有限公司。

2.2 三七花提取物的制备

取药材三七花1 kg，分3次分别加水10 、8、8 L加热提取，每次提取2 h，提取温度为90 ℃，3次提取液过滤后合并，浓缩至1 L左右，经离心除去沉淀物，上清液经冷冻干燥获得三七花提取物。

2.3 检测

2.3.1 提取物的成分分析

分别参照2015版《中国药典》中人参总皂苷的测定方法[8]以及《保健食品功效成分检测方法》(2002版)中“可溶性粗多糖测定方法”测定所得样品的总皂苷及可溶性多糖的含量。

2.3.2 实验分组

试验设62.5、125、250、500和1 000 μg/mL 5个剂量组和1个空白对照组，作用时间设6 h和24 h 2组。

2.3.3 靶细胞液的制备

试验前24 h将YAC-1细胞进行传代培养，试验开始前用HBSS液洗涤靶细胞2次，再用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度至1×104个/孔。

2.3.4 效应细胞液的制备

效应细胞液为脾细胞悬液，在无菌环境下摘取小鼠脾脏，在盛有适量无菌HBSS液的小皿中用镊子将脾脏磨碎；组织液经200目筛网过滤后再以1 500 r/min离心5 min收集沉淀；沉淀部分用Gey’s红细胞裂解液混悬，2 min后用预冷的HBSS清洗沉淀物3次；沉淀细胞用RPMI1640完全培养液(含500 ng/mL rhIL-2)培养3 d，试验开始前再将细胞浓度稀释至1×105个/孔，获得效应细胞悬液[9]。

2.3.5 受试样品制备

试验开始前，在洁净实验室内精密称取三七花提取物冻干粉(经辐照灭菌)，以RPMI1640完全培养液溶解后经微孔滤膜过滤，以培养液稀释制备62.5、125、250、500和1 000 μg/mL等5个不同剂量的受试样品溶液备用。

2.3.6 吸光度检测

实验设试验组、空白对照组、靶细胞自然释放组和靶细胞最大释放组(完全裂解)。试验组为细胞液中添加不同浓度三七花提取物的样本组；空白对照组为细胞液中添加等量不含三七花提取物的空白溶剂(培养液)组；靶细胞自然释放组为不添加任何物质的NK细胞悬液；靶细胞最大释放组为添加裂解液促使体系内靶细胞完全裂解的样品组。试验组中在96孔板内分别加入50 μL不同浓度的受试品溶液，再分别加入50 μL靶细胞悬液效应细胞悬液，在细胞培养箱中(37℃，5% CO2)孵育6 h和24 h。

孵育结束前45 min，在靶细胞最大释放组内加入15 μL裂解液(10×)，然后将圆底培养板以250 g的离心力离心4 min；从每孔吸取50 μL上清液转移至新的96孔板中，再向新的96孔板每孔中加入50 μL反应底物，用无菌铝箔封板膜覆盖板子使之避光，室温孵育30 min后，每孔加入50 μL 终止液，于1 h内测定吸光度值A490。

3 实验结果的数据处理及结果判定

NK细胞的活性可通过以下公式计算获得：

NK细胞活性=

NK细胞活性的比较采用空白组与试样组各组间t检验的方法进行显著性分析；三七花提取物作用6和24 h后小鼠NK细胞活性变化的显著性分析是在不添加三七花提取物，只在孵育结束前添加裂解液的情况下，小鼠NK细胞活性与空白组存在显著性差异(p≤0.01)的条件下，以试样组与空白组之间进行t检验分析。当NK细胞活性增强，且p≤0.01时，则判定为试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，该试验结果为阳性，试样对小鼠NK细胞活性有增强效果。

4 实验结果与讨论

4.1 三七花提取物成分的检测

经检测三七花提取物的可溶性多糖含量为75.48%，总皂苷含量为5.35%。

4.2 吸光度检测数据

实验每组设6个平行，所测得的吸光度值如表1所示。

4.3 数据处理与分析

三七花提取物对NK细胞活性影响的试验中，NK细胞活性检测的吸光度值及NK细胞活性的计算结果如表2所示。

表1 实验各组的吸光度值A490

表2 NK细胞活性检测吸光度值和NK细胞活性 %

注：*：p<0.05，样品组比空白组；**：p<0.01，样品组比空白组。

图1和图2分别示出三七花提取物作用靶细胞6和12h后检测的NK细胞活性。

图1 三七花提取物对NK细胞活性的影响，作用时长6h

图2 三七花提取物对NK细胞活性的影响，作用时长24h

由图1、图2可知：在三七花提取物的质量浓度为62.5和125 μg/mL时，试样组小鼠NK细胞的活性与空白对照组比较，作用时间为6 h的时候，试样组的NK细胞活性略低于空白组(12.2±0.95%)，分别为10.53±1.33%和11.95±0.86%；作用时间为24 h时，2个浓度的试样组小鼠NK细胞活性分别为26.78±3.02%和29.27±1.56，空白组为28.00±0.84%；小鼠NK细胞的活性均无显著性差异。从图1和图2可以看出，在三七花提取物质量浓度≥250 μg/mL时，作用6和24 h后，试样组小鼠NK细胞的活性增强，与空白组比较存在显著性差异，且随着三七花提取物质量浓度的提高，小鼠NK细胞的活性增强。

实验数据表明，三七花提取物质量浓度高于250 μg/mL时，作用6和12 h后，试样组的NK细胞活性均显著高于对照组，三七花提取物具有一定的NK细胞活性增强作用。

5 讨论

该实验以三七花为原料，经水提、过滤、浓缩、冻干所获得的三七花提取物，其多糖含量高达75.48%，总皂苷含量为5.35%，经检测该提取物在质量浓度范围为62.5～1 000 μg/mL内对小鼠NK细胞的活性均有增强作用，且在质量浓度高于250 μg/mL时，其增强作用更加明显。NK细胞在免疫系统中具有重要作用，在固有免疫效应中，NK细胞能够双向调节T/B淋巴细胞的免疫反应；另外，O’Leary等[10]研究T/B细胞缺乏的小鼠半抗原引起的接触性超敏反应中发现NK细胞具有记忆性，之后Lopez-Verges等[11]研究发现该缺陷型小鼠接触化学性半抗原一个月后将致敏小鼠的肝脏NK细胞移植至受体小鼠体内，受体小鼠也可产生不依赖于T/B淋巴细胞的免疫反应，表明NK细胞具有适应性免疫作用。

6 结论

由以上实验结果可以推测，三七花提取物具有一定的免疫调节作用，能够通过促进NK细胞的活性进而调节机体的免疫功能，可用于具有增强免疫力功能的保健食品开发。在云南地区，三七花已被批准作为地方特色食品原料进行管理，可作为一般原料更广泛地应用于各类普通食品中。三七花提取物的提取工艺简单，对环境友好，不产生污染物。加强对三七花化学成分及生物学功能的研究，开展三七花资源深加工，对促进地区产业经济发展具有重要意义，对其他中草药的开发利用也具有一定的参考价值。