靶向乙肝病毒核心蛋白治疗慢性乙型肝炎的研究进展

戴胜兰 姚俊 许亚平

[摘要] 乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白是HBV核衣壳的组成部分，参与病毒包装、病毒成熟以及病毒向细胞外释放等过程，具有cccDNA调节功能并参与诱导机体免疫反应。本文就HBV核心蛋白的结构、功能以及在HBV治疗中的研究进展等方面，综述了近年来靶向HBV核心蛋白治疗慢性乙型肝炎的研究现状，表明核心蛋白质变构调节剂（CpAMs）可作为抗HBV药物直接靶向HBV核心蛋白而干扰其活性，利用HBV核心蛋白为靶抗原诱导HBV特异性免疫反应具有抗HBV及免疫调节作用，以期为慢性乙型肝炎的治疗发展提供参考。

[关键词] 乙型肝炎病毒；慢性乙型肝炎；核心蛋白；共价闭合环状DNA；免疫反应

[中图分类号] R512.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（a）-0035-04

[Abstract] Hepatitis B virus （HBV） core protein is an integral part of HBV nucleocapsid， which is involved in viral packaging， viral maturation and viral releasing to the outside of cells. Core protein participates in regulation of cccDNA function and the induction of immune responses. This paper summarizes the research progress of targeting hepatitis B virus core protein in the treatment of chronic hepatitis B in recent years， starting from the structure and function of HBV core protein and the progress in the treatment of HBV. All of these indicate that core protein allosteric modulators （CpAMs） can directly interfere with the activity of HBV core protein as anti-HBV drugs， and the use of HBV core protein as a target antigen to induce HBV-specific immune responses has anti-HBV and immunomodulatory effects.These provide a theoretical reference for the development of treatment for chronic hepatitis B.

[Key words] Hepatitis B virus； Chronic hepatitis B； Core protein； Covalently closed circular DNA； Immune response

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的肝臟慢性炎症性疾病。据统计，全世界约有2.4亿慢性HBV感染者，每年约有50万人死于CHB相关的并发症（如肝硬化和肝细胞癌等）[1]。当前使用的抗病毒药物主要为核苷（酸）类似物和干扰素-α，可以有效抑制HBV增殖，减缓乙型肝炎患者的发病进程，但由于不能作用于共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），很难彻底清除病毒[2]。HBV核心蛋白是HBV核衣壳的组成部分，具有重要的生物学特性和功能，在T细胞和B细胞水平上，HBV核心蛋白的抗原性较乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HbeAg）强100倍，几乎所有HBV感染者都产生HBV核心抗体（hepatitis B virus core antibody，HBcAb），同时存在T细胞免疫应答，机体对核心蛋白的免疫应答在清除HBV过程中具有重要作用[3]。因此HBV核心蛋白已成为抗HBV治疗的重要而有前景的干预目标。本文针对HBV核心蛋白的结构、功能以及在HBV治疗中的研究进展进行综述。

1 生物学特性

1.1 HBV核心蛋白的结构特征

HBV核心蛋白由183个氨基酸残基组成，分子量约21 kD。在HBV复制期间，信使RNA（mRNA）从HBV C基因的开放阅读框架转录，翻译从C基因的第二个密码子AUG开始。起始的149个氨基酸残基形成富含α螺旋的装配结构域，也被称为球形的N末端（Nterminal domain，NTD），而末端的34个氨基酸残基形成富含精氨酸的C端域（Cterminal domain，CTD）[4]。HBV核心蛋白构成同型双聚体，自行组装为20面体的核壳。分为两种类型：90个双聚体形成三角形数为3（T=3）对称，31 nm颗粒；120个双聚体形成三角形数为4（T=4）对称，35 nm颗粒。乙型肝炎患者体内这两种颗粒均存在，体积稍大的颗粒占多数[5]。

1.2 HBV核心蛋白与cccDNA的关系

HBV慢性感染的根源是cccDNA的存在，细胞外乙型肝炎病毒DNA是一种松弛环状的双链DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）分子，在乙肝病毒的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，形成cccDNA，cccDNA是HBV前基因组RNA复制的原始模板，虽然其含量较少，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的目标。然而，多年来用核苷类似物治疗可以防止形成新的病毒粒子，但只是偶尔导致病毒的消失[6]。cccDNA与核心蛋白的相互作用知之甚少。从稳定转染的AD38细胞中分离的cccDNA鉴定核心蛋白，研究发现其与核小体数目的变化相关[7]。染色质免疫沉淀（chromatin immuno-precipitation，ChIP）显示核心蛋白与CpG岛优先关联[8]。CpG岛2上核心蛋白的存在与cccDNA活性增加（即病毒载量）相关，而CpG岛2和3中DNA的甲基化与cccDNA活性降低相关[8-9]。有研究推测驱动核心蛋白装配的小分子[10]降低了游离核心蛋白的浓度，导致cccDNA结合核心蛋白的减少，使得病毒RNA及蛋白质产量减少。E3泛素连接酶NIRF1被认为是消耗cccDNA结合的核心蛋白的另一机制，也导致cccDNA活性抑制[11-12]。这些研究表明，HBV核心蛋白有助于表观遗传调控cccDNA，从而有利于延长cccDNA寿命。

干扰素α（IFN-α）被认为可能在表观遗传学水平上可以清除HBV感染[13]，但仅在一部分患者中有效。在对免疫调节剂（IFN-α和淋巴毒素β受体抗体）作用机制的研究中，发现有证据表明胞苷脱氨酶APOBEC3A通过与cccDNA结合的核心蛋白直接相互作用被募集到cccDNA，使cccDNA容易被核酸酶降解[13]。这一发现提出了为什么HBV蛋白会招募病毒抑制蛋白的问题。核心蛋白也可以募集NIRF1来调节其稳定性和组蛋白修饰[11-12]。这些研究结果表明核心蛋白具有cccDNA调节功能。

1.3 HBV核心蛋白与机体免疫反应

HBV核心蛋白参与IFN-α介导的cccDNA的破坏[13]。并且核心蛋白与干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISG）之间的相互作用也参与其中。在细胞系研究中发现HBV核心蛋白抑制双链DNA介导的IFN应答。这种抑制的必要条件是核心蛋白的核位置可抑制ISG的转录[14]。核心蛋白也与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumour necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）相互作用，TRAIL与HBV感染的肝细胞死亡有关。核心蛋白的过度表达可减少TRAIL诱导的人肝癌细胞凋亡，这与死亡受体5的表达减少有关[15]。

核心蛋白不仅作为病毒结构蛋白，还涉及HBV复制中的许多重要功能，参与病毒包装、病毒成熟以及病毒向细胞外释放等过程。核心蛋白也是B细胞、T辅助细胞和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）免疫介导的病毒清除的目标[16]。氮末端（N-terminal domain，NTD）NTD和碳末端（C-terminal domain，CTD）都可表达CTL和T细胞的表位，而B细胞表位主要在NTD上发现。这些表位的突变已显示可影响机体免疫反应[17-18]。在人类病例中，突变在CTL表位CTD的磷酸化位点与高级别肝纤维化相关[19]。核心蛋白通过与机体免疫因子相互作用，可调节病毒活性和肝细胞损伤，对核心蛋白的免疫应答在病毒清除中可能具有重要意义。

2 靶向乙肝病毒核心蛋白在慢性乙型肝炎治疗中的应用

2.1 直接靶向HBV核心蛋白的抗病毒药物

核心蛋白具有组装惰性衣壳之外的活性，小分子可以通过作用于具体的核心蛋白构象而差异地干扰每一种活性，这类小分子物质被称为核心蛋白质变构调节剂（core protein allosteric modulators，CpAMs）。CpAMs的作用機制可分为3类：①形成异常装配的核衣壳（而不是二十面体晶格）；②形成不能包裹前基因组RNA（pregenomicRNA，pgRNA）的“正常形状”核衣壳，即空壳体；③干扰形成新的cccDNA。

杂芳基二氢嘧啶（HAPs）是被研究较多的一类通过第一种机制起作用的CpAMs。体外研究表明，HAPs在广泛的浓度范围内促进核心蛋白装配成无功能衣壳聚合物[10，20]。不同的HAPs导致不同形式的衣壳聚合物[10]。除了影响壳装配外，HAP在显示病毒抑制活性时所需浓度远低于影响衣壳组装所需要的浓度，这表明HAPs抗病毒活性的动力学效应与异常衣壳结构无关[21]，且在小鼠体内研究中未发现严重毒性。

苯丙烯酰胺（PPAs）通过第二种机制起作用（即形成不能包装pgRNA的空壳体）的另一类CpAMs。细胞培养中发现这些化合物抑制HBV感染并可加速衣壳装配[22]。PPAs存在时，衣壳组装正常，仍然形成具有正常形态的二十面体核衣壳[23]。然而这些“正常的核衣壳”没有包裹pgRNA，导致积累的空衣壳影响后续下游的病毒学复制。这些研究表明，PPAs的作用机制处于病毒衣壳和RNA包装水平[24]。

HAP12是高浓度靶向装配一类CpAMs，可以通过抑制cccDNA复制靶向cccDNA形成。研究表明，HAP12可弱结合核心蛋白变构影响cccDNA[25]。作用于核心蛋白的装配上游的这种变构调节剂是否具有降低cccDNA活性和控制慢性感染的潜力尚需进一步研究。

2.2 基于HBV核心蛋白的治疗性疫苗

Maini等[26]研究发现在能够抑制HBV复制及阻遏肝脏损伤的CHB患者体内存在较高的HBc特异性CTL水平，研究证实了CHB患者体内存在保护性的肝源性HBc特异性CTL和致病性抗原非特异性免疫。以上研究为应用以核心蛋白为基础的免疫干预治疗CHB提供了理论基础。Heathcote等[27]在20世纪90年代就以核心蛋白的表位为基础治疗CHB患者。HBV转基因小鼠含有HBV基因组和所有HBV相关抗原，可用来评估疫苗的效果。Akbar等[28]在HBV转基因小鼠体内评估以核心蛋白为基础的细胞疫苗对肝内免疫力的影响，研究发现，以核心蛋白为基础的疫苗免疫后，血清中HBsAg转阴并产生抗-HBs。此外，肝脏内可检测到HBs和HBc特异性CTL。另外，在HBV感染的鸭和土拨鼠模型中已经显示了HBV核心蛋白作为试验性治疗性疫苗的作用[29-30]。利用HBV核心蛋白为靶抗原诱导HBV特异性免疫反应在治疗慢性HBV感染方面具有重要意义。研究发现将HBV核心蛋白强制泛素化后，核心蛋白降解速度加快，诱导的免疫反应增强，强制泛素化的核心蛋白体外可诱导DC成熟、刺激T淋巴细胞增殖及产生HBV特异性CTL反应[31-33]，在小鼠体内可诱导HBc特异性CTL反应，并可抑制HBV复制[34-35]。但目前可供人类应用的HBV核心蛋白疫苗仍然需进一步研究开发。

3 结语

近年来，对于HBV核心蛋白的结构及功能已经有了较深入的认识，核心蛋白作为病毒结构蛋白，参与病毒包装、病毒成熟以及病毒向细胞外释放等过程，并与机体免疫反应有关。靶向核心蛋白的治疗包括CpAMs和治疗性疫苗有望为抗HBV提供了新的治疗策略，但目前仍然缺乏临床研究来评价，有待进一步的研究证实。

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