阴炎净洗液HPLC—DAD双波长指纹图谱研究

田霞 肖作奇 黄懿 潘涛 欧阳波

[摘要] 目的 建立阴炎净洗液的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱分析方法。 方法 依利特ODS2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，柱温为25℃，检测波长选择210 nm和280 nm。 结果 建立了阴炎净的HPLC指纹图谱，标示出33个共有色谱峰，同时对其中5个色谱峰进行归属。 结论 双波长指纹图谱实现了较为全面的评价，建立的方法灵敏、准确、简单，分离效果好，可作为阴炎净洗液质量评价的方法。

[关键词] 阴炎净洗液；指纹图谱；高效液相色谱；质量控制

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（a）-0027-05

[Abstract] Objective To establish fingerprint methods in Yinyanjing Lotion by high performance liquid chromatography （HPLC）. Methods A Hypersil ODS2 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used， the flow rate was 1.0 mL/min. The mobile phase was acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution with gradient elution at 25℃. The flow-rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 210 nm and 280 nm. Results The common modes for the HPLC fingerprints were set up by ensuring 33 common peaks in the chromatograms. 5 chemical constituents were analyzed qualitatively. Conclusion Dual-wavelength chromatographic fingerprint can realize the analysis of a formula as a whole. This method is sensitive， accurate and simple， and can be used for the quality control of Yinyanjing Lotion.

[Key words] Yinyanjing Lotion； Fingerprint； High performance liquid chromatography； Quality control

阴炎净洗液是湖南省妇幼保健院临床使用20余年的妇科洗液，由苦参、黄连、连翘、蛇床子等九味中药组成，有杀菌、止痒等功效，临床将其用于妇科阴道炎、宫颈炎等疾病的辅助治疗[1]。处方中苦参所含的苦参碱和氧化苦参碱具有很好的抗菌、消炎作用[2-5]；黄连中小檗碱也是公认的抑菌有效成分[6-7]；连翘苷是消炎的主要有效成分[8-9]；蛇床子素有祛湿杀虫的疗效[10-11]。这些化学成分是阴炎净常用的质量控制指标，前期研究中，本研究仅对其中一个或两个成分含量进行控制[12-14]，但中药复方成分复杂，一个或两个成分的测定不能反映该方的整体药效，指纹图谱技术是对该方的全成分进行测定，可提高对该方质量的控制。

文献和实验研究结果表明，方中苦参碱和氧化苦参碱仅在低于230 nm波长处有吸收值，而低波长范围内高效液相色谱（HPLC）图的基线容易漂移，所以单波长难以实现对方中的成分进行全面测定和评价。参照相关文献报道[15-20]，本研究选用二极管阵列检测器（DAD）进行检测，选用两个波长融合后的指纹图谱对阴炎净洗液进行质量评价。

1 仪器与材料

电子分析天平（德国，Mettler Toledo XS205型，精度0.1 mg）；电子天平（日本，X4205型）；0.22 μm微孔滤膜（美国，密理博）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进）；超声清洗器（上海科导，HS-2060）；高效液相色谱仪（日本岛津公司，LC-20A型）；二极管阵列检测器（岛津，SPD-M20A）；柱温箱（岛津，CTO-10AS）；色谱柱（Hypersil ODS2，5 μm，4.6 mm×250 mm），乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。小檗碱对照品（110713-200911）、苦参碱对照品（110805-200306）、氧化苦参碱（110780-201007）、连翘苷（110821-201213）和蛇床子素对照品（0822-200204）均来源于中国食品药品检定研究院。阴炎净洗液（批号：141015、141016、141017、141018、141028、141029、141030、141104、141105、141106）由湖南省妇幼保健院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 色譜条件

Hypersil ODS2色谱柱，流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱程序见表1。检测波长为200～400 nm，流动相流速1.0 mL/min，柱温为25℃，进样量10 μL。

2.2 对照品溶液配制

分别精密称取小檗碱、苦参碱、氧化苦参碱、蛇床子素和连翘苷适量，用甲醇分别配制成浓度为0.672、1.213、0.694、1.648、0.896 mg/mL的溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液。取各对照品溶液200 μL混合均匀，制得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取阴炎净洗液20.0 mL，置100 mL容量瓶中，加入乙醇定容，摇匀，取中间层溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 精密度试验及参照峰的选择

取供试品溶液（批号：141015），按“2.1”项下条件连续进样6次进行测定。考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果所有共有峰相对保留时间均相对标准差（RSD）≤1.96%，共有峰相对峰面积值均RSD≤1.92%，提示该方法精密度良好。30号峰峰面积最大，因此将其选为本研究的参照色谱峰。

2.5 重复性试验

按“2.3”项下供试品溶液制备方法，取同一批阴炎净洗液（批号：141015）平行制备6次，按“2.1”项下条件分别进样测定。结果各共有峰相对保留时间均RSD≤1.76%，峰面积值均RSD≤2.19%，提示方法重复性好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液（批号：141015），按“2.1”项下条件于0、2、4、6、12、24 h分别测定1次，共测6次，考察各共有峰的相对保留时间和峰面积值，结果各共有峰相对保留时间均RSD≤2.34%，峰面积值均RSD≤2.19%，提示供试品溶液24 h内稳定。

2.7 指纹图谱的建立

分别取10批次不同批号的阴炎净洗液，按“2.1”项下条件分别测定。从岛津LC-solution工作站中分别导出10批次阴炎净洗液在210 nm（图1A）处和280 nm（图1B）的色谱图，再导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统的操作规范软件（版本2004A）中，分别导出色谱图txt文件，0～30 min选择210 nm数据，30～120 min選择280 nm数据，将两个时间段内数据合并得到每批次阴炎净洗液双波长融合指纹图谱（图1C）。将10批次阴炎净洗液双波长融合指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统的操作规范软件（版本2004A），进行多点校正后，然后匹配生成对照指纹图谱（图2），共确定33个共有峰，每批次阴炎净洗液与对照指纹图谱比较相似度均>0.988（表2），批次之间差异>0.964。

2.8 与对照品对照确定峰归属

各对照品溶液和混合对照品溶液的分析结果见图3。苦参碱和氧化苦参碱在280 nm的色谱图中没有色谱峰出现，双波长融合后5中对照物质的色谱峰均能得到有效的体现。结果表明，阴炎净洗液色谱图中的5号峰为苦参碱，6号峰为氧化苦参碱，25号峰为连翘苷，30号峰为小檗碱，32号峰为蛇床子素。

3 讨论

本研究选用HPLC-DAD对阴炎净洗液的全成分指纹图谱进行研究，研究结果表明，单波长280 nm各成分之间分离较好，有较多成分能得到体现，但是方中的主要活性成分苦参碱和氧化苦参碱的色谱峰峰高很低，难以体现；在单波长210 nm处，苦参碱和氧化苦参碱有较大的峰高值，其中9、10号峰也能较好地分离，但是30～60 min内的成分分离较差，且100 min后有严重的信号漂移，蛇床子素的色谱峰得不到体现；综合考虑选用双波长融合法对阴炎净洗液的指纹图谱进行研究。

阴炎净洗液的化学成分复杂，该方法得到了33个共有色谱峰。文献检索结果[2-11]表明，苦参碱、氧化苦参碱、连翘苷、小檗碱和蛇床子素等5种成分为该制剂主要抗菌、抗炎成分，由此，本研究对这5种成分对应的色谱峰进行了指认。该方法精密度、重复性、稳定性等均符合要求，能全面地评价阴炎净洗液的质量。本研究尚处于初步阶段，指纹图谱与药材和相关性有待进一步研究。

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