归脾汤对雷公藤醇提物致肝损伤大鼠肝细胞线粒体保护作用

周文静，柴 智，李艳彦，高 丽，闫润红，周 然，王永辉

（山西中医药大学，山西晋中030619）

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）为卫矛科植物（Celastraceae）雷公藤属（Tripterygium）一年生藤本植物的干燥根［1］，具有祛风止痛、除湿消肿等功效，广泛用于治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病，疗效确切。但雷公藤有肝毒性，文献报道其为单味中药导致肝损伤的最主要药物［2］。如何能减轻其肝损伤，提高临床利用率，是需要解决的问题。我们利用中医经典方剂归脾汤防治雷公藤醇提物所致大鼠的肝损伤，实验研究显示作用明显［3］。前期研究已从脂质过氧化反应、代谢等方面进行作用机理探讨［4］，近年来，肝细胞线粒体的研

究引起密切关注，本实验观察了雷公藤所致肝损伤后对肝线粒体△Ψm和ATP酶水平以及氧化情况的影响，以期进一步从肝细胞线粒体角度研究雷公藤醇提物所致肝损伤的发生机制以及归脾汤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实动动物 SPF级SD大鼠30只，体质量100～120 g，雌雄各半，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号为SCXK（京）2009-0004。动物购回后雌雄分笼饲养于（22±2）℃、55%湿度环境中，自由摄水摄食，适应性饲养1周后开始实验。

1.1.2 药材及雷公藤醇提物的制备 雷公藤药材由山西省药品检验所鉴定为卫矛科植物雷公藤的干燥根，来源于江西九江。将雷公藤药材干燥，用粉碎机将药材粉碎成细粉，用95%乙醇10倍体积于1 600 g雷公藤细粉，浸泡12 h，超声处理45 min，补足重量，离心，取上清液，用旋转蒸发仪减压回收上清液中乙醇，干燥，取得药材粉末150.49 g，即为制备好的雷公藤醇提物，计算得每克提取物相当于原雷公藤药材10.63 g，即提取率为9.41%。归脾汤（黄芪、人参、白术、当归、龙眼肉、茯神、酸枣仁、远志、木香、甘草）按《证体类要》中提供诸药比例称重，药材购自北京同仁堂药材有限责任公司。在原药材中加10倍水，浸泡1 h，水煎煮2次，每次煎煮30 min，合并滤液，用纱布滤除药渣，浓缩滤液后含生药1 g/mL，即浓度为100%，药液4℃保存备用。1.1.3 仪器与试剂 LR4001旋转蒸发仪（德国HEIDOLPH公司），DL-5-B低速大容量离心机（上海安亭），BS224S型万分之一电子天平（德国赛多利斯集团），FACS Cali bur流式细胞仪（美国BD公司），USA1489-2010全自动生化分析仪（西门子医疗诊断有限公司）。凯基细胞悬液制备试剂盒（批号KGA829）由南京凯基生物科技有限公司提供，Na+-K+-ATP酶测试盒（Na+-K+-ATPase，批号A070-5）、Ca2+-Mg2+-ATP酶测试盒（Ca2+-Mg2+-ATPase，批号A070-5）均由南京建成科技有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 分组与造模 将30只健康SD大鼠随机分为正常组、模型组与归脾汤组3组，每组10只。归脾汤组按照9 g/kg剂量灌胃归脾汤，每天1次，连续4 d；模型组与空白组灌服等体积的生理盐水。从第5天开始模型组与归脾汤组大鼠按照3.25 mg/kg剂量灌服雷公藤醇提物，每天1次，连续3 d，肝损伤造模成功［3］；正常组灌服等体积生理盐水。

1.2.2 肝组织线粒体的制备 制备大鼠肝线粒体［5］：大鼠末次给药后禁食12 h，将大鼠处死，迅速从肝门静脉注射预冷的0.25 M蔗糖溶液，取一部分肝脏组织，剪碎，除去血红蛋白，用0.25 M蔗糖溶液冲洗3次，剪成匀浆状；继续将预冷的4倍于肝重的0.25 M蔗糖溶液加入其中，用匀浆机匀浆，制成肝匀浆；以100 000 g，4℃冷冻离心肝匀浆30 min；取上清液，再将上清液离心60 min，弃去上清液，沉淀用1倍于肝重的甘油-Tris-HCl-KCl缓冲液，涡旋混匀，分装备用，即为纯化的线粒体。

1.2.3 样品检测 取已制备的肝组织，按试剂盒说明书操作步骤，测定肝组织线粒体的SOD、MDA、GSH 的 含 量 以 及 Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性。

检测肝细胞线粒体膜电位，根据凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒的要求，吸取500 μL所配的JC-1工作液加入线粒体沉淀中，将细胞均匀悬浮，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育20 min；室温下以 2 000 rpm，离心 5 min，弃去上清，沉积细胞加入一定量1×Incubation Buffer，漂洗2次，再以2 000 rpm，室温离心5 min，弃去上清；吸取1×Incubation Buffer 500 μL重新悬浮细胞，上流式细胞仪检测。肝细胞线粒体膜电位水平以FL1、FL2的双阳性细胞数与门内细胞总数百分比来表示。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织线粒体SOD、MDA、GSH含量的比较

结果见表1。

表1 各组大鼠肝组织线粒体SOD、MDA、GSH含量的比较（±s）

表1 各组大鼠肝组织线粒体SOD、MDA、GSH含量的比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01

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由表1可见，与正常组比较，模型组大鼠的肝组织线粒体 SOD、GSH 水平明显降低（P＜0.01）；MDA 水平则明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，归脾汤组大鼠肝组织线粒体GSH、SOD水平提高，MDA 水平降低（P＜0.01）。

2.2 各组大鼠肝组织线粒体ATP酶活性的比较

结果见表2。

表2 各组大鼠肝组织线粒体ATP酶活性的比较 （μmol·h/μg，±s）

表2 各组大鼠肝组织线粒体ATP酶活性的比较 （μmol·h/μg，±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01

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由表2可以看出，与正常组比较，模型组大鼠的肝组织线粒体Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase水平明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，归脾汤组可提高大鼠肝组织线粒体Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase水平（P＜0.01）。

2.3 各组大鼠肝细胞线粒体膜电位△Ψm水平的比较

结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肝细胞△Ψm 水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，归脾汤组大鼠肝细胞△Ψm水平明显升高（P＜0.01）；结果见图 1，表 3。

图1 各组大鼠肝细胞线粒体膜电位△Ψm水平的比较

表3 各组大鼠肝细胞线粒体膜电位△Ψm的水平比较 （±s）

表3 各组大鼠肝细胞线粒体膜电位△Ψm的水平比较 （±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01

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3 讨论

各种肝损伤的发生与线粒体功能异常有关，因为许多促进肝细胞凋亡的信号主要作用于线粒体。一般通过改变线粒体膜通透性，抑制氧化磷酸化发生，下降ATP酶的活性，促进生成活性氧，使线粒体发生变化，从而导致线粒体功能障碍。而线粒体功能障碍构成了细胞存亡的控制中心，在细胞坏死和凋亡中都起着重要的作用［6-7］。所以线粒体损伤途径是肝损伤发生的重要机制之一。

线粒体膜电位（△Ψm）可以反映线粒体的通透性，为观察线粒体功能结构正常与否的灵敏指标［8］。线粒体膜电位对线粒体内环境的稳定非常重要，当线粒体跨膜电位稳定时能够防止细胞的凋亡［9］，而细胞凋亡的重要环节就是线粒体跨膜电位的下降。同时ATP酶产生的最主要场所就在线粒体，ATP酶的产生从而为细胞正常生命活动提供所需绝大多能量［11］。其中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase存在于组织细胞及细胞器的膜上，其活力大小是细胞功能有无损伤的重要指标［15-16］。另外线粒体是氧自由基生成的主要细胞器，线粒体的结构与功能受到影响时，导致过多的氧自由基启动脂质过氧化反应或消耗氧自由基清除剂，进一步造成细胞损伤［12］。Mn-SOD、GPx等是线粒体内主要抗氧化酶［10］，其中GSH是GPx的底物，又是一种低分子自由基清除剂［13］。当脂质过氧化反应和自由基造成线粒体膜损伤时，会伴随ATP酶活性降低，进而导致ATP酶合成不足与线粒体膜流动性降低，最终形成肝细胞的死亡［14］。

结果显示，雷公藤醇提物能引起肝细胞线粒体△Ψm水平下降以及Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低，可能通过肝细胞线粒体结构变化与ATP酶的活性下降，氧自由基生成增加，进而导致脂质过氧化反应物的增加与抗脂质过氧化物的减少，最终造成肝细胞线粒体的损伤。归脾汤可防治雷公藤所致肝损伤大鼠肝细胞线粒体△Ψm的降低，减少脂质过氧化反应物MDA生成，提高肝线粒体ATP酶的活性，进一步保护肝线粒体膜结构和功能的完整性，从而提高机体的抗氧化损伤能力，达到保护肝脏作用。