苦参碱衍生物的合成及其对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制的影响

冯婷婷，严佳佳

（1.山西中医药大学，山西晋中030619； 2.山西振东制药有限公司，山西晋中030619）

苦参作为传统中药，味苦、性寒，具有清热、解毒、利尿、祛风、杀虫作用［1-2］。其主要成分苦参碱在抗菌、抗炎、抗过敏、抗心律失常、消肿利尿、免疫及生物调节等方面有明显的药理作用［3］。近年来还有报道其有较强的抗肿瘤活性作用［4-5］，对黑色素瘤、胃癌、膀胱癌、上皮性卵巢癌和乳腺癌等都有不同程度的抑制作用［6-10］。目前对苦参碱的结构修饰主要以槐果碱的研究最多（其原因为槐果碱可修饰的活性位点较多，易于进行结构修饰）［11］，而直接以苦参碱为母体进行修饰的研究相对较少。本实验将苦参碱水解、酯化，然后在无水四氢呋喃溶液中，氢化钠作用下，与芳香醛缩合生成相应的产物，并通过细胞体外实验，观察其对癌细胞增殖的抑制作用。对结果进行分析，我们得到了一个未见文献报道的新化合物（见图1）。以苦参碱做对照，在相同条件下，将得到的苦参碱衍生物作用于人胃癌SGC-7901细胞，结果表明其对人胃癌SGC-7901细胞呈现明显的增殖抑制作用。本文在苦参碱修饰和抗肿瘤方面为研究者提供了实验基础。

图1 苦参碱衍生物的合成路线

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Bruker 400MHz超导核磁共振仪，LCQ ACL离子肼液质联用仪，Nicolet系列傅立叶变换红外光谱仪，RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚容生化仪器厂），SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，85-2型控温磁力搅拌器；苦参碱（陕西天之润生物科技有限公司），苯甲醛（天津登丰化学品有限公司），对氟苯甲醛（萨恩化学科技有限公司），氢化钠（华北地区特种试剂开发中心，分析纯），无水四氢呋喃（阿拉丁试剂），氢氧化钠（天津登丰化学品有限公司，分析纯），浓盐酸（天津登丰化学品有限公司，分析纯），人胃癌SGC-7901细胞株（上海细胞库），FBS胎牛血清（Hyclone），细胞培养液（Gibco），噻唑蓝（Sigma），DMSO（Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 苦参碱水解 在250 mL单口瓶中加入5 g（0.020 1 mol）苦参碱，50 mL 甲醇，20 mL 水，50 mL氢氧化钠饱和溶液。加热至110℃，搅拌回流10 h。冷却后，调pH至7～8，旋干，固体分别用氯仿、无水甲醇洗涤3次除去未反应的苦参碱，得到苦参酸钠盐与NaCl的混合物。

1.2.2 苦参酸酯化 在250 mL三口圆底烧瓶中加入30 mL二氯亚砜，冰浴下用恒压滴液漏斗缓慢滴加无水甲醇20 mL，冰浴下搅拌0.5 h，然后缓慢滴加含有3 g苦参酸钠盐与NaCl混合物的无水甲醇溶液50 mL。滴加完毕，移除冰浴，加热至60℃，反应6 h。冷却，冰浴下调pH为7，旋干溶剂，加入无水甲醇，过滤除去NaCl，用石油醚洗涤，除去苦参碱。得到纯的苦参酸甲酯，产率65.1%。

1.2.3 苦参酸甲酯与苯甲醛缩合［8-9］在100 mL三口圆底烧瓶中加入0.050 g（1 mmol）苦参酸甲酯，0.120 g（5 mmol）氢化钠，15 mL 无水四氢呋喃，60 ℃搅拌反应1 h，缓慢加入0.530 g（5 mmol）苯甲醛，TLC监测，至苦参酸甲酯完全反应，停止反应，冷却，用冷无水乙醇猝灭氢化钠，旋干溶剂，加入氯仿溶解，以氯仿/甲醇（1∶1，v/v）做洗脱液，用硅胶柱（200～300目）过滤，得0.037 g黄色油状物a。

1.2.4 苦参酸甲酯与对氟苯甲醛缩合［8-9］在100 mL三口圆底烧瓶中加入 0.050 g（1 mmol）苦参酸甲酯，0.120 g（5 mmol）氢化钠，15 mL 无水四氢呋喃，60 ℃搅拌反应 1 h，缓慢加入 0.530 g（5 mmol）对氟苯甲醛，TLC监测，至苦参酸甲酯完全反应，停止反应后，冷却，用冷得无水乙醇猝灭氢化钠，旋干溶剂，加入氯仿溶解，以氯仿/甲醇（6∶1，v/v）做洗脱液，用硅胶柱（200～300目）过滤，得0.018 g黄色油状物b。

1.2.5 苦参碱衍生物1的合成［8-9］在100 mL三口圆底烧瓶中加入 0.280 g（1 mmol）苦参酸甲酯，0.120 g（5 mmol）氢化钠，15 mL无水四氢呋喃，60℃搅拌反应1 h，TLC监测，至苦参酸甲酯完全反应，停止反应后，冷却，用冷无水乙醇猝灭氢化钠，旋干溶剂，加入氯仿溶解，用硅胶柱（200～300目）过滤，以氯仿/甲醇（6∶1，v/v）过滤，得 0.11 g 苦参碱衍生物。

1.2.6 细胞培养 人胃癌SGC-7901细胞生长于玻璃底培养皿中，培养基采用含10%（v/v）胎牛血清的高糖 Dulbecco′s modified eagle media（DMEM）液体培养基，环境温度为37℃，CO2浓度控制在5%的饱和湿度的培养箱中培养。1～2 d换液，每3～4 d传代1次，选用对数生长期细胞进行实验。

1.2.7 MTT法检测细胞增殖 取含1.0×106个/mL密度细胞悬液200 μL接种于96孔培养板上，在环境温度为37℃、CO2浓度为5%以及饱和湿度的条件下培养，待细胞贴壁后进行实验。用苦参碱作为对照实验，考察苦参碱衍生物对人胃癌SGC-7901细胞的杀伤作用。将稀释为不同浓度的药液（100 μM、200 μM、400 μM、800 μM）分别加入到各孔中，每个浓度设6个复孔，并设只加细胞不加药液的对照孔，只加DMSO溶剂的空白孔。继续培养48 h后，每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 μL，孵育4 h停止培养，1 500 rpm离心10 min，小心地弃去上清，每孔加DMSO150 μL，振荡5 min，用免疫酶标仪（波长570 nm）比色。根据测得的OD值计算细胞的存活率。

2 结果

2.1 苦参碱衍生物1

通过质谱、氢谱、碳谱、红外确证苦参酸甲酯分别与苯甲醛、对氟苯甲醛缩合，生成相应的产物a和b，与回流苦参酸甲酯的产物一致，均为苦参碱衍生物 1。元素分析，计算值（%）：C，72.54；H，9.74；N，11.28；实测值：C，72.51；H，9.79；N，11.22.ES-MS（CH3OH，m/z）：519.0［M+Na］+）.IR（KBr）（νmax/cm-）1：3420，2930，2850，2020，1732，1601，1523，1514，1491，1450，1423，1382，1314，1235，1181，1147，882，801，651.1H NMR （400 MHz，CDCl3）：4.68（s，4H），4.52（d，2H），4.10（s，2H），3.77（s，1H），3.28（br m，4H），2.44-2.48（br m，4H），2.23-2.28（m，4H），2.15 （t，4H），2.01（d，4H），1.90（s，4H），1.79（br m，5H），1.48-1.76 （br m，4H），1.39-1.42（q，3H），1.26（s，2H），0.90（s，1H）.13C NMR（400 MHz，CDCl3）：169.71，128.74，115.31，64.37，56.69，32.69，27.25，18.16。

2.2 苦参碱衍生物对人胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用

以苦参碱作为对照，将得到的苦参碱衍生物对人胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用进行研究。结果见图2。从图2可知，在实验浓度下（≤800 μM），苦参碱没有明显的细胞增殖抑制作用，而苦参碱衍生物效果较为明显，在浓度为200 μM时已呈现出明显的抑制作用。相同浓度下，苦参碱衍生物的效果优于苦参碱，且随着浓度的增加，其细胞增殖抑制作用逐渐增强。

图2 苦参碱、苦参碱衍生物对人胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用比较

3 讨 论

3.1 苦参碱衍生物1的合成

苦参碱水解得到苦参酸钠盐后，用水将苦参酸钠盐溶解，稀盐酸调pH值为5～6，TLC监测，显示部分苦参酸钠盐转化为苦参碱，过柱得到产物产率太低，且浪费溶剂。将苦参酸钠盐直接酯化，反应过程中也有苦参碱生成，在硅胶柱分离过程中，发现始终有苦参碱交叉点出现，且产物越来越少，多次验证，发现苦参酯在过柱过程中水解，转化为苦参碱。最后采用洗涤的方法除去苦参碱，得到苦参酸甲酯，其方法为：用乙醚洗涤效果最好，但乙醚较贵，回收损失太大，最终选择石油醚洗涤，效果较佳。

本实验最后一步初期思路是在无水四氢呋喃溶液中，氢化钠作用下，苦参酸甲酯分别与苯甲醛、对氟苯甲醛缩合，生成相应的产物，如图1。在反应过程中，TLC监测反应进程，当苦参酸甲酯反应完全后，停止反应，过柱分离得到产物，通过质谱、氢谱、碳谱、红外确证苦参酸甲酯与苯甲醛、对氟苯甲醛反应的产物一致。于是另设反应：在无水四氢呋喃溶液中，氢化钠作用下，回流苦参酸甲酯，得到目标化合物，通过质谱、氢谱、碳谱、红外确证其产物与回流苦参酸甲酯与苯甲醛和对氟苯甲醛反应的产物一致，均为苦参碱衍生物1。推测其机制可能为：苦参酸甲酯首先在氢化钠作用下，发生酯的氨解，生成苦参碱，苦参碱与苦参酸甲酯在氢化钠作用下，生成苦参碱衍生物1。

3.2 苦参碱衍生物对人胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用

近年来，苦参碱和氧化苦参碱在抗肿瘤方面有较多的研究，在临床上作为抗癌的辅助药物也得到了广泛的应用。通过实验得到，在低浓度下，我们修饰过的苦参碱衍生物对人胃癌SGC-7901细胞增殖表现出了良好的抑制作用。我们通过对苦参碱进行结构修饰，提高了其抗癌活性，本文在苦参碱修饰和抗肿瘤方面为研究者提供了实验基础。

综上所述，本文合成了一种新的苦参碱衍生物，该物质对人胃癌SGC-7901细胞增殖有抑制作用，可以作为抗癌辅助药物。