葡萄籽原花青素单组分对PC12细胞的毒性研究

杨智超，宋丽娟，宋俊丽，姜维佳，王 青

（1.山西中医药大学国家中医药管理局益气活血重点研究室，山西晋中030619； 2.山西医科大学第二附属医院，山西太原030001）

关键字 葡萄籽原花青素；PC12；细胞毒性

葡萄籽提取物（Grape seed extract，GSE）是从葡萄籽中提取到的一类富含多酚类物质的混合物，它的有效成分主要是原花青素。葡萄籽原花青素（Grape seed proanthocyanidin，GSP）是由不同数目的黄烷醇-儿茶素（Catechin，C）和表儿茶素（Epicatechin，EC）聚合而成，根据聚合度的不同，将二-四聚体称为原花青素低聚体（oligomeric proanthocyanidin，OPCs），五聚体以上的称为原花青素高聚体（polymeric proanthocyanidin，PPCs）。现在已鉴定出3种单体，14种二聚体，11种三聚体［1］。在这些物质当中，含量最多的是单体、C、EC、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）以及原花青素二聚体。

葡萄籽原花青素是活性最强的一类天然抗氧化剂，具有抗炎、抗过敏、清除自由基、预防心血管疾病和中枢退行性疾病、保护肾脏和神经元等生理功能，因此在欧美等发达国家的医药、化妆品和保健品市场受到极大的好评。但是混合物在使用的过程中存在着靶点不明确、毒性不可控等缺点。因此，科研工作者致力于研究葡萄籽原花青素的单组分，发现C具有抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化和抗溃疡的作用［2］；EC可以抗菌、消炎、镇咳；EGCG 能抗炎、抗氧化、抗过敏［3］；二聚体B1（Procyanidin B1，B1）和原花青素 B2（Procyanidin B2，B2）具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等作用，只是B2的生物活性更强［4-5］。而且这些化合物还能够通过血脑屏障迅速到达中枢神经系统，可以成为治疗中枢神经疾病的良药，具有非常大的研究潜力［6-7］。但这些化合物的神经毒性尚未被系统评价。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（Pheochromocytoma，PC12）具有神经元细胞的特性，已广泛应用于神经药理、神经毒理和神经生化等领域的研究。本研究以PC12细胞为模型，初步探索了4种葡萄籽原花青素单体对PC12增殖的影响，为其在神经领域的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

CO2培养箱（Thermo），全波长酶标仪（Molecular Devices），小型垂直电泳槽（Bio-Rad），小型半干转膜仪（Bio-Rad），小型基础通用电源（Bio-Rad），凝胶成像系统（Bio-Rad），DMEM培养基（Gibco），大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞，高分化型，武汉大学细胞库），胎牛血清（HyClone），噻唑蓝（碧云天），PVDF膜（milipore），BCA 试剂盒（康为世纪），RAPI细胞裂解液（上海生工），ECL（爱必信），小鼠Bcl-2抗体（Bioworld），小鼠 Bax抗体（Bioworld），辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗（中杉金桥）。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT实验 用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养高分化的PC12细胞后，取96孔培养板，用密度为5×105/mL的细胞铺板，每孔100 μL，隔夜培养后，各孔分别加入浓度为 2.5 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，50 μg/mL 和100 μg/mL 的 C、EC、B1 和 B2，孵育 24 h、48 h 和72 h后，各孔加入5%的 MTT10 μL，37 ℃孵育4 h后，弃去培养液，每 孔 加 入 100μL DMSO溶解，在490 nm处检测，测定其OD值。空白组加入等体积的含有10%胎牛血清的高糖DMEM。

1.2.2 Western blot 实验 PC12细胞用100 μg/mL 的 C、EC、B1 和B2分别孵育72 h后，收集细胞，使用RAPI裂解液，裂解PC12细胞，提取总蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白上样量为20 μg，12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转膜，5%脱脂奶粉封闭后，一抗4℃过夜，二抗孵育后用ECL法曝光。

1.3 统计学方法

应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。结果用均数±标准差（±s）表示。单因素方差分析（One-Way ANOVA）后，用Dunnett′s test分析方法比较组间差异。两组间比较采用T-test法。

2 结果

2.1 PC12 细胞增殖实验

葡萄籽原花青素单聚体C和EC（30 μg/mL，50 μg/mL和100 μg/mL）可促进PC12细胞增殖，且具有时间和浓度的依赖性。而100 μg/mL的B1和B2孵育PC12细胞24 h，对细胞增殖没有影响，而随着作用时间延长，有抑制细胞增殖的趋势；30 μg/mL和50 μg/mL的B1和B2随着作用时间延长，可促进PC12细胞增殖。结果见图1～图4。

2.2 PC-12细胞Bcl-2和Bax蛋白的检测

100 μg/mL葡萄籽原花青素 C、EC、B1和B2孵育PC12细胞72 h后，发现B2可显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达，对促凋亡蛋白Bax没有影响。

3 讨 论

图1 C对PC12细胞增殖的影响

图2 EC对PC12细胞增殖的影响

图3 B1对PC12细胞增殖的影响

图4 B2对PC12细胞增殖的影响

图5 C，EC，B1和B2对PC12细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

本研究显示，C和EC可促进PC12细胞增殖，没有细胞毒性；高浓度的B1和B2随着作用时间延长，表现出了抑制细胞增殖的趋势，提示长期大剂量服用B1和B2可能会导致细胞毒性。为了进一步证实MTT的实验结果，我们考察了高浓度（100 μg/mL）的C、EC、B1 和 B2 对PC12细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表达的影响，发现B2可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。Bcl-2家族是重要的调控细胞凋亡基因，其中起主要作用的是抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，且两者之间的比例不同对细胞凋亡的影响也不同。Bcl-2/Bax升高则细胞趋于存活，反之则细胞趋于凋亡［8-9］。根据实验结果，我们认为B2使PC12细胞中Bcl-2/Bax降低，从而促使细胞趋于凋亡。

葡萄籽原花青素中二聚体（OPCs）生物活性最强，研究最为广泛的OPCs，且他们的抗氧化活性远远大于其单体C和EC［10］。因此，认为二聚体是更具潜力的抗氧化剂，加之其药理活性优异，使二聚体的单组分研究成为众多研究者的首选课题［11］，但对其的毒性研究却鲜有报道。本研究发现，二聚体B1和B2与单体C和EC相比，表现出了一定的细胞毒性，说明二聚体在生物活性增加的同时其毒性也有所增加。综上所述，原花青素随着聚合度的增加其细胞毒性也可能会增加，因此，在实际生产过程中应尽量富集低聚合度的葡萄籽原花青素组分，去除高聚合度的原花青素，以达到增效减毒的目的。