盐碱胁迫下喷施BR对甜菜光系统Ⅱ和氮代谢关键酶的影响

李彩凤，刘 丹，邹春雷，刘 磊，武沛然，杨芳芳，王 彬，王玉波

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

土壤过度利用已成为农业生态环境问题，尤其在我国干旱和半干旱地区，土壤盐碱化频发[1]。土壤盐碱化是影响作物生长、发育、生产力和地理分布最重要环境因素之一[2-3]。土壤盐碱化使作物生长遭受胁迫，作物产量降低影响因子中，土壤盐碱化占20%[4]。

甜菜（Beta vulgaris L.）是我国北方经济作物，是极少的耐盐碱作物之一，对盐碱土具有强适应性[5]。耿贵等研究表明，低浓度盐碱胁迫下，甜菜对NO3-吸收增强，叶面积增大；但高浓度盐（土壤电导率大于7 mΩ·cm-1）会产生盐害，影响甜菜体内离子平衡，抑制其正常生长[6]。

油菜素内酯是植物体内的类固醇类激素，与其他植物激素一样，对植物生长发育起重要调节作用[7]。寇江涛等研究表明，BR在提高作物抵抗逆境、增强光合作用、促进生长发育和增加产量等方面效果显著[8]。目前BR人工合成类似物等已广泛应用于各种蔬菜、农作物生产[9-10]。BR在缓解甜菜盐碱胁迫研究未见报道。因此，本试验通过在不同时期喷施BR，研究其对甜菜叶绿素荧光特性和氮代谢关键酶影响，探索喷施BR最佳时期，为今后研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甜菜品种为KWS0143，产于德国艾恩贝克，由卡韦埃斯种子欧洲股份有限公司引进。

1.2 试验设计

2017年在黑龙江省哈尔滨市东北农业大学农学院作盆栽试验。供试基础土壤为自然黑钙土。土壤基础肥力：有机质35.66 g·kg-1，碱解氮176.27 mg·kg-1，速效磷83.3 mg·kg-1，速效钾153.2 mg·kg-1。

盆栽桶上径30.0cm，下径24.0cm，高26.5cm，每桶装10 kg风干土壤。土壤中加入含Na+质量浓度为3 g ·kg-1中性盐和碱性盐（NaCl：Na2SO4：NaHCO3：Na2CO3=4：2：2：1）模拟大田盐碱土。化肥施用量按照N180kg·hm-2、P2O590kg·hm-2、K2O 90 kg ·hm-2，按面积施肥。将试验土、盐碱和化肥混匀装入桶中。

4月31日播种，每桶播50粒种子，试验设对照（CK）、叶丛快速生长期（Q）、块根膨大期（Z）、糖分积累期（H）共四个处理。分别在甜菜叶丛快速生长期（6～8片叶）、块根膨大期、糖分积累期，选择晴朗天气上午9:00～9:30，喷施0.15 mg·L-1BR，以吐温-20作展着剂在叶片正反两面均匀喷施。喷施BR 10 d后取样，两次取样时间间隔为18 d，共5次。取样时间为上午9:00～10:00，各处理随机取3株，选出叶龄一致功能叶片，测量叶绿素荧光参数。然后剪下叶片，迅速液氮处理后于-80℃冰箱保存，备用。

1.3 试验方法

1.3.1 叶绿素含量测定

叶绿素含量测定采用乙醇提取法[11]，取新鲜叶片测定，每个处理重复3次。

1.3.2 叶绿素荧光参数测定

利用PAM-2500便携式脉冲调制叶绿素荧光仪，上午9:00～10:00测定各处理叶片（叶片选择生长时期一致完全的功能叶片）PSⅡ最大光合速率Fv/Fm、PSⅡ实际光能转换效率（YⅡ）、光化学淬灭（qL）、非光化学淬灭（NPQ）和PSⅡ相对电子传递速率[rETR（Ⅱ）]，专用叶片夹夹持叶片（避开叶脉部分），暗处理20 min后测量，每个处理重复3次，各指标参照Klughammer等公式计算处理[12]。

1.3.3 氮代谢相关酶测定

1.3.3.1 硝酸还原酶（NR）测定

参考于海滨等方法[13]，测定内源NR活力，以μg NO2-（生成）·g-1FW·h-1表示，每个处理重复3次。

1.3.3.2 谷氨酰胺合成酶（GS）测定

酶提取液按照Zhang等方法[14]，活性测定按照Lea等方法[15]，利用分光光度计在540 nm下测定吸光值，用γ-谷胺酰基羟亏酸作标准曲线，根据标准曲线确定酶活性。

1.3.3.3 谷氨酸合成酶（GOGAT）测定

酶提取液与测定GS酶液相同。谷氨酸合成酶活性测定参照Singh等方法[16]，由L-谷氨酰胺启动反应，利用分光光度计在340 nm下测定吸光值变化，以每min下降0.001个吸光值为1个酶活单位。

1.4 数据处理与分析

Excel 2010数据分析软件处理数据和制图，表中数据以平均数±标准误表示，采用SPSS22.0作差异显著性分析及相关分析。

2 结果与分析

2.1 不同时期喷施BR对甜菜叶绿素含量影响

通过分析表1叶绿素各项指标变化情况，整体来看，对照处理叶绿素含量随时间呈先降后升再降趋势。叶丛快速生长期喷施BR，提高甜菜叶片叶绿素含量。7月4日和7月22日取样中，Q处理叶片叶绿素a含量比CK分别高38.44%和72.34%，叶绿素b含量分别高38.57%和53.38%；甜菜块根膨大期和糖分积累期，Q处理叶绿素a和叶绿素b含量比CK略低，差异均不显著。块根膨大期喷施BR降低叶片叶绿素含量。8月10日和8月28日取样中，Z处理叶绿素a含量分别低于CK 46.05%和44.34%，叶绿素b含量分别低于CK 77.06%和85.23%。9月15日取样中，Z处理叶绿素a和叶绿素b含量分别高出CK 43.19%和25.96%，块根膨大期喷施BR后叶绿素a和b含量均与CK处理差异显著。甜菜糖分积累期喷施BR显著提高叶片叶绿素含量，H处理叶绿素a和b含量分别高出CK处理33.99%和16.74%。喷施BR在提高叶绿素含量同时，也提高叶绿素a相对含量，叶丛快速生长期喷施BR后，第一次取样（7月4日）结果显示，各处理叶绿素a/b均为3.94，无明显差异；在第二次取样（7月22日）时Q处理叶绿素a/b为4.56，显著高于CK处理的3.36，且在甜菜整个生长过程中Q处理始终高于CK。块根膨大期和糖分积累期喷施BR后，Z与H处理叶绿素a相对含量也呈升高趋势。

表1 不同时期喷施BR对甜菜叶绿素含量影响Table1 Effect of spraying BR on chlorophyll content of sugar beet at different stages (mg·g-1 FW)

2.2 不同时期喷施BR对甜菜叶绿素荧光系数影响

2.2.1 喷施BR对叶片光能转换效率影响

由图1可知，最大光能转换效率在甜菜整个生长期变化呈先升后降再升趋势。叶丛快速生长期喷施BR后，7月4日与7月22日测定中Q处理分别高出CK 2.05%和0.04%；块根膨大期喷施BR后Z处理在第一次取样（8月10日）时测量系数与CK无明显差异，而在8月28日和9月15日测定中大幅度降低，与各处理差异显著，分别低于CK 2.85%和2.28%，低于Q处理1.82%和2.03%，；糖分积累期喷施BR后H处理叶片的最大光能转换效率均高于其他处理，且差异显著。

图1 不同时期喷施BR对叶绿素最大光能转换效率影响Fig.1 Effect of spraying BR on chlorophyll Fv/Fm at different stages

图2 不同时期喷施BR对叶绿素实际光能转换效率影响Fig.2 Effect of spraying BR on chlorophyll YⅡat different stages

图2 显示，叶片实际光能转换率随甜菜生长期呈先升后降变化，CK在8月10日出现峰值，Q处理在7月22日出现峰值。7月4日、7月22日和8月28日Q处理实际光能转换系数分别高出CK 8.65%、1.86%和2.40%，但9月15日显著低于CK，仅为其66.99%；块根膨大期喷施BR后，8月10日Z处理低于CK，但8月28日高于CK，与最大光能转换效率趋势不同；糖分积累期喷施BR的H处理显著低于CK，但略高于Q处理。

图1和图2说明不同时期喷施外源BR对叶片光能转换效率均有影响，喷施时期不同，作用效果不同，且对最大光能转换效率和实际光能转化率影响不同。

2.2.2 喷施BR对叶片光化学淬灭系数影响

图3和图4分别表示甜菜叶片叶绿素光化学淬灭和非光化学淬灭系数变化情况。由图3可知，CK处理光化学淬灭系数变化趋势随生长时间呈先升后降趋势，Q处理光化学淬灭系数随生长时间逐渐下降。7月4日和7月22日Q处理光化学淬灭系数最高，分别高于CK 30.40%和32.32%，与其他处理差异显著，叶丛快速生长期喷施BR提高叶丛快速生长期叶绿素光化学淬灭系数。块根膨大期喷施BR后，8月10日测定时Z处理光化学淬灭系数显著低于CK，8月28日和9月15日取样显著高于CK和Q处理，糖分积累期喷施BR后H处理光化学淬灭系数降低，与CK处理差异不显著。

图4显示，甜菜整个生长期叶片叶绿素非光化学淬灭系数变化呈先降后升趋势，7月22日最低（均低于0.25），9月15日最高（均高于0.9）。Q处理显示，叶丛快速生长期喷施BR后，除8月28日测定系数略低于CK（差异不显著），其他生长时期均高于对照，且差异显著，5次取样中Q处理分别为CK处理142.64%、148.74%、369.57%、89.57%和206.06%。Z处理显示，块根膨大期喷施BR后并未立即提高甜菜叶片非光化学淬灭系数，与CK处理差异不显著，8月28日和9月15日测定中，Z处理显著高出CK 24.16%和15.58%；糖分积累期数据显示，在甜菜生长三个时期喷施BR均显著提高叶片非光化学淬灭系数。

2.2.3 喷施BR对叶片电子传递速率影响

如图5所示，叶丛快速生长期喷施BR提高叶片叶绿素相对电子传递速率。7月4日和7月22日测定数据显示，Q处理高出CK 8.7%、26.4%，8月10日Q处理是CK的84.72%，显著低于CK；块根膨大期喷施BR后，块根膨大期未明显提高叶片相对电子传递速率；喷施BR三个处理在糖分积累期叶片相对电子传递速率均低于对照，9月15日测定中，Q、Z、H三个处理相对电子传递速率分别为CK 90.2%、80.4%和71.3%。喷施越晚，对糖分积累期叶片相对电子传递速率抑制越显著。

图3 不同时期喷施BR对叶绿素光化学淬灭影响Fig.3 Effect of spraying BR on chlorophyll qL at different stages

图4 不同时期喷施BR对叶绿素非光化学淬灭影响Fig.4 Effect of spraying BR on chlorophyll NPQ at different stages

图5 不同时期喷施BR对叶绿素相对电子传递速率影响Fig.5 Effect of spraying BR on thechlorophyll r ETR(Ⅱ)at different stages

2.2.4 喷施BR对叶片光保护能力影响

叶绿素在强光照射下光保护能力参数指标变化见图6，其变化趋势与非光化学淬灭参数基本一致，在甜菜生长过程中呈先降后升趋势。叶丛快速生长期喷施BR除8月28日测定数据外，其他时间均显著高于对照，Q处理在甜菜生长期叶片光保护能力高于CK；块根膨大期喷施BR后，Z处理在块根膨大期叶片光保护能力并未显著提高；9月15日测定结果显示，三个时期喷施BR均显著提高甜菜糖分积累期叶片光保护能力，Q、Z和H处理参数分别是CK 171.17%、181.98%和180.18%。

图6 不同时期喷施BR对叶绿素光保护能力影响Fig.6 Effect of spraying BR on chlorophyll photoprotective ability at different stages

2.3 不同时期喷施BR对甜菜氮代谢关键酶活性影响

2.3.1 喷施BR对甜菜叶片NR活性影响

由图7可知，甜菜叶片NR活性在7月4日最高，随生长期递进降低并趋于稳定。叶丛快速生长期喷施BR后，Q处理NR活性在7月4日至7月22日显著高于CK，分别高出15.4%、57.2%，且在生长期一直高于CK；块根膨大期喷施BR后，Z处理显示，NR活性显著降低并一直低于CK；糖分积累期喷施BR后叶片NR活性显著低于CK处理。结果表明叶片喷施BR影响甜菜NR活性，叶丛快速生长期喷施提高NR活性，其他生长时期喷施抑制叶片NR活性。

2.3.2 喷施BR对甜菜叶片GOGAT活性影响

如图8所示，喷施BR后对甜菜叶片NADHGOGAT活性影响显著。CK处理叶片GOGAT变化随生长期呈先降后升趋势；叶丛快速生长期喷施BR后，叶片GOGAT活性先降后升，生长期活性逐渐递增，5次取样分别为CK 21.99%、78.38%、205.18%、134.94%和138.89%；Z处理显示，块根膨大期喷施BR后NADH-GOGAT活性降低，8月10日和8月28日活性均显著低于CK处理，9月15日活性升高并显著高于CK；糖分积累期喷施BR后，H处理的叶片GOGAT活性下降。试验结果显示，在甜菜生长各时期外源喷施BR后，叶片NADH-GOGAT活性均呈先降后升趋势。

图7 不同时期喷施BR对叶片NR活性影响Fig.7 Effectsof spraying BR on leaves NR activity at different stages

2.3.3 喷施BR对甜菜叶片GS活性影响

图9为叶片GS活性随生长时期变化趋势。由CK处理可知，叶片GS活性随甜菜生长时期推进呈缓慢上升趋势，叶丛快速生长期和块根膨大期变化不显著，在糖分积累期达最高。叶丛快速生长期喷施BR后，显著提高GS活性，在7月4日、7月22日和8月28日分别高出CK 15.1%、33.0%、16.5%；糖分积累期Q处理与CK变化趋势不同，GS活性不升反降，并显著低于其他处理；块根膨大期喷施BR后GS活性略降低，与CK相比变化不明显；糖分积累期喷施BR后GS活性升高。叶丛快速生长期喷施BR提高该时期和块根膨大期叶片GS活性，降低糖分积累期活性；其他两个时期喷施BR对甜菜叶片GS活性无显著影响。

图8 不同时期喷施BR对叶片GOGAT活性影响Fig.8 Effect of spraying BR on leaves GOGAT activity at different stages

图9 不同时期喷施BR对叶片GS活性影响Fig.9 Effect of spraying BR on leaves GSactivity at different stages

2.4 叶绿素a与荧光参数和氮代谢关键酶活性相关性分析

叶绿素是与甜菜叶片荧光特性相关重要指标，分析叶绿素a与荧光参数相关性，结果如表2所示，通过比较两处理与叶绿素a相关性，发现除Fv/Fm外，其他荧光参数YⅡ、qL、NPQ、rETR（II）和Y（NPQ）/Y（NO）与叶绿素a相关系数均在喷施BR后升高，可能因叶面喷施BR后缓解胁迫，叶绿素光合能力恢复。喷施BR前qL与叶绿素a含量相关程度仅为0.875，喷施BR后达极相关（0.996），表明喷施BR可缓解盐碱对叶绿素a伤害，提高PSⅡ光化学反应。整体来看，通过喷施BR，可提高甜菜叶片叶绿素a含量，同时提高叶片PSⅡ对光能吸收、转化效率和光保护能力。

通过分析两处理氮代谢关键酶与叶绿素a含量相关系数发现，喷施BR后，硝酸还原酶（NR）活性与叶绿素a相关程度提高，相关系数由0.388提高到0.694，表明喷施BR可提高盐碱胁迫下叶片NR活性；盐碱胁迫下，GS活性与叶绿素a含量呈负相关（-0.727），喷施BR后，GS活性与叶绿素a含量呈正相关（0.429）；喷施BR前，GOGAT活性与叶绿素a含量相关系数仅为-0.146，外源喷施BR后叶片GOGAT活性与叶绿素a含量呈显著负相关（-0.900），可能因叶片GOGAT活性直接受外源BR限制。

表2 叶绿素与荧光参数相关性分析Table 2 Correlation analysis of chlorophyll and fluorescenceparameters

3 讨论与结论

盐碱胁迫降低叶片叶绿素含量，影响植物光合作用。本研究发现，甜菜叶丛快速生长期叶面喷施BR显著提高盐碱胁迫下叶片叶绿素含量，与刘强等研究结果一致[17]；在块根膨大期喷施BR后叶绿素含量下降，与刘海英等研究结果相反[18]，可能是植物差异所致。本试验中，甜菜叶片喷施BR后，叶片叶绿素含量和光合能力均显著提高。叶绿素a和b是参与叶片光合作用重要物质，叶绿素a是光合作用中心色素分子，一般情况下，叶绿素a/b值越高，说明叶片光照下光合能力越强。本试验喷施BR处理叶绿素a/b值均高于盐碱处理（CK），与马野等研究结果一致[19]。三个时期喷施BR后均显著提高糖分积累期叶绿素b含量，可能是甜菜生长后期光照变弱环境下提高叶片光能吸收利用能力所致，其他研究目前尚未见同类报道。

研究表明，高浓度盐胁迫下，植物光合效率降低主要原因之一是Fv/Fm、光化学淬灭、电子传递速率下降[20-21]。本试验结果显示，盐碱胁迫下喷施BR提高甜菜叶片Fv/Fm、YⅡ、qL和相对电子传递速率，提高叶片光合能力。光照强度是影响植物光合作用重要因素，植物在强光下光合作用受到抑制，但可通过非光辐射热耗散途径散发剩余光能降低强光胁迫[22]，相关研究表明，其他环境胁迫会降低叶片对强光适应能力[23]。研究显示，盐碱胁迫限制甜菜叶片叶绿素a活性，环境光照较强情况下，叶片吸收光能能力下降，光耗散能力降低，喷施BR后，PSⅡ实际光能转换率和光保护能力均显著增强，同时各荧光指标（除Fv/Fm）与叶绿素a含量相关性均有所提高，说明外源喷施BR可缓解盐碱对叶片叶绿素a破坏，提高甜菜光合作用，与Shu等研究结果一致[24]。

氮代谢途径是叶片内氮素转化关键途径。寇江涛研究结果显示，盐胁迫下喷施BR提高苜蓿幼苗体内NR、GS和GOGAT活性[25]，扈雪欢等研究认为，外源施入水杨酸可提高盐胁迫下颠茄叶片氮代谢关键酶活性[26]。本试验结果表明，叶丛快速生长期喷施BR可提高盐碱胁迫下甜菜生长期叶片NR和GS活性，但每次喷施BR后NADH-GOGAT活性均呈先降后升趋势，与寇江涛和扈雪欢等研究结果不同，可能是本试验浓度BR抑制NADHGOGAT活性，随时间推移BR浓度降低，NADHGOGAT活性逐渐升高并高于对照，也说明BR直接影响叶片NADH-GOGAT活性，这种影响不受作物生长期限制，但未见其他研究报道。

本研究通过分析盐碱胁迫下甜菜各时期喷施BR处理叶绿素、荧光参数和氮代谢关键酶变化数据，发现各时期喷施外源BR对甜菜生理指标均有影响，同一时期喷施BR不同生理指标变化影响不同，不同时期喷施BR对同一生理指标影响也存在差异。整体来看，在叶丛快速生长期（六叶期）喷施BR与其他两个时期相比对甜菜生长更有效。