大豆胞囊线虫病4号生理小种抗性候选基因GmRSCN4-3克隆与功能初步鉴定

韩英鹏，孙秋霞，包冬芳，董海冉，张婵娟，赵 雪，李文滨

（东北农业大学大豆研究所，大豆生物学教育部重点实验室，农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150030）

大豆是重要油料和粮食作物，也是世界植食性蛋白和油脂重要来源[1]。大豆胞囊线虫病（Soybean cyst nematode，SCN）俗称“火龙秧子”，是世界性大豆病害，影响大豆产量和品质[1-2]。SCN一般可造成减产20%～30%，严重时可减产70%～80%，甚至造成绝产[3-5]。研究表明，成熟胞囊线虫可在土壤中存活长达9年[6]。国际上，SCN被划分为多个不同生理小种，各生理小种分布区域及致病性不同，其中3号生理小种抗源较多，相关遗传研究报道较多[7-9]。我国目前已发现8个生理小种，包括1号、3号、4号生理小种，其中4号小种侵染力最强[10-11]，主要分布在黄淮海和东北大豆主产地区，但4号生理小种相关遗传研究较少。轮作倒茬、化学药剂、生物防治、合理施肥和灌溉等农艺措施对大豆胞囊线虫有防治作用，选育和利用抗病品种是该病害最有效控制措施之一。

分子辅助育种具有周期短，准确性高且可克服不良性状连锁优点[12]，是培育抗性品种有效途径之一。大豆胞囊线虫抗性由多个基因控制[13]，克隆并验证抗病候选基因，设计其连锁标记用于分子辅助选择，可提高大豆抗线虫育种效率[14]。目前抗病基因（R-gene）在植物基因组中占比大，约占基因数1%～2%[15-17]，表达物蛋白质具有保守结构域特征，如C-端存在富亮氨酸重复区段（Leucine-rich，LRR），亮氨酸拉链（Leucinezipper，LZ），跨膜结构域（Transmembrancedomain，TM）等[18-19]。Cook等研究表明，大豆胞囊线虫病抗性由3个相互独立隐性基因Rhg1、Rhg2、Rhg3[7-8,20]和一个显性抗病基因Rhg4控制[9,21-22]。通过基因沉默发现rhg1-b位点附近的31 kb范围内编码3个与抗病相关基因，这3个基因在抗病和感品种之间存在拷贝数变异[20]。rhg4位点位于LGA2（8号染色体）上，与控制有色种的i位点连锁[23-24]，结构上与rhg1相似[25]，通过编码丝氨酸羟甲基转移酶（Shmt）控制丝氨酸和甘氨酸互变对SCN产生抗性。此外，HsL-pro1也被证明具有抗线虫作用[26-27]。

本研究以抗病种质东农L-10为试验材料，拟克隆抗病候选基因GmRSCN4-3全长序列，并构建植物表达载体pCambia3300-GmRSCN4-3，利用发根农杆菌介导大豆快速转化技术及酸性品红染色法作功能初步鉴定，可为分子辅助育种提供基因资源。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验选用2017年种子，包括大豆胞囊线虫病4号生理小种抗性品种东农L-10，感病品种东农50及辽豆15为受体材料，以上材料均由东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室保存。

大豆胞囊线虫病4号生理小种采集自黑龙江省安达大豆连作地块，由东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室分离、纯化并保存。

1.2 方法

1.2.1 胞囊分离、继代及计数

本研究采用淘洗过筛法从病土中分离胞囊，接种高感大豆品种辽豆15扩大繁殖。35 d后，将分离获得的胞囊机械法破碎，释放卵粒26℃条件下孵化7 d，孵化出二龄幼虫（J2）混制成2 000条·mL-1卵悬液，用于接种鉴定。

采用塑料钵柱法，在温室中鉴定大豆胞囊线虫4号生理小种抗性，复合植株装在高温灭菌后沙土（1∶1）中，以每株2 000条接种2龄时期幼虫，24～26℃按照干湿交替补充水分培养15 d后，采用酸性品红染色法统计根上雌性胞囊数。

1.2.2 大豆根部总RNA提取及反转录

将东农L-10种植在蛭石中，培养条件为光照（28℃/16 h），黑暗（28℃/8 h），水分充足，15 d后取大豆根部，利用Invitrogen TrizoL®Reagent RNA提取试剂盒说明书操作，提取大豆根部总RNA，具体方法参考陈安乐研究[28]。

1.2.3 GmRSCN4-3生物信息学分析

利用 ProtParam tool（http://www.expasy.ch/toools/protparam.html）在线工具分析氨基酸序列理化性质[5]。 应 用 ProtScale（http://ca.expasy.org/tools/prots cale.html）工具中Hphob./Kyte&Doolittle算法计算氨基酸序列亲水性与疏水性。

1.2.4 大豆GmRSCN4-3基因克隆与表达载体构建

1.2.4.1 东农L-10 cDNA第一条链合成

计算提取RNA浓度：OD260×0.04μg·μL-1×100（稀释倍数），μg·μL-1。按TOYOBOReverTra Ace qPCRRTMaster Mix with gDNA Remover试剂盒说明操作，cDNA第一条链合成体系（10μL）：在小离心管中配置以下混合液：4×DNMaster Mix（已添加gDNA Remover）2 μL； RNA template 0.5 pg～0.5 μg；Nuclease-free Water至总体积 8μL。37℃条件下金属浴温育5 min后，迅速至于碎冰上；瞬时针离心混合物，使其沉积在小离心管底部；冰上加样操作，在上述离心管中配置以下反应液：上述模板 RNA 8 μL；5×RT Master Mix II 2μL。37℃，15 min；50℃，5 min；98℃，5 min；4℃，结束程序，放于-20℃保存。

1.2.4.2 PCR引物设计

根据Phytozome v12.1中的GmRSCN4-3基因序列信息，所用载体pCAMBIA3300酶切位点信息，选取XbaⅠ作为酶切位点，采用Primer Premier 5.0软件作目的基因引物设计（见表1），由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.2.4.3 PCR扩增体系

以东农L-10根部cDNA为模板，扩增目的基因序列，扩增片段长度为700 bp。KOD-FX-PCR反应体系（50μL）如下：Autoclaved，distilled water（33-X）μL，10× PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 1×5 μL，dNTPs（0.2 mmol · L-1）5 μL，MgSO4（1.5 mmol·L-1）3 μL，引物（0.3 μmol· L-1each）1.5 μL，模板cDNA（200 ng·50μL-1）X μL，KOD-Plus-Neo（1 U ·50μL-1）1μL；94℃预变性 2 min，98℃变性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸温度30 s·kb-1，共36个循环，4℃保存。

表1 目的基因扩增引物Table 1 Genes and corresponding primersfor PCR

1.2.4.4 目的基因片段回收

1%琼脂糖电泳检测PCR产物，利用全自动数码凝胶图像分析仪拍照记录后，根据OMEGA Gel Extraction Kit（D2500-01）凝胶回收试剂盒说明书方法操作，回收目的条带，-20℃保存备用。

1.2.4.5 线性化植物表达载体与目的基因片段连接

在pCAMBIA3300载体多克隆位点上找到单酶切位点XbaⅠ，根据所选酶切位点将植物表达载体pCAMBIA3300酶切线性化。酶切反应体系为：XbaⅠ（10 U·μL-1）1 μL，10×Buffer Tango 4 μL，载体质粒20μL，ddH2O 14μL，反应条件：37℃金属浴4～5 h，电泳验证酶切结果。

1.2.4.6 目的基因与克隆载体In-Fusion连接与转化

大肠感受态（E.coli）DH5α购自宝日医生物技术（北京）有限公司，热激法转化目的基因。In-Fusion方法将线性化pCAMBIA3300载体与目的基因片段连接反应体系如下：5×In-Fusion HD Enzyme Premix 1μL，目的片段1μL，XbaⅠ酶切pCambia3300载体 1μL，Autoclaved,distilled water 2μL，反应总体积5μL，轻弹并混匀样品，50℃链接3 h。

1.2.4.7 菌液验证及测序

采用Easy-Taq菌液PCR方法检验阳性克隆，挑取6个1μL培养菌液作为模板PCR鉴定。吸取300μL鉴定正确菌液交由北京华大基因科技有限公司测序。菌液PCR反应体系（20μL）为：10×buffer with Mg2+2μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 0.3μL，引物 1μL，菌液 1μL，Easy-taq 0.3μL，ddH2O 15.4μL；预变性:94℃,5 min，变性：94℃，30s，退火：58℃，30 s，延伸温度：72℃，1 min·kb-1，共36个循环，终延伸72℃，5 min，4℃保存。将测序合格样品，根据OMEGA公司Plasmid Mini Kit I（D6942-02*）试剂盒说明书按步骤提取质粒。

1.2.5 发根农杆菌（K599）侵染

选择长势一致4 d苗龄大豆幼苗，使用一次性1 mL注射器收集无菌水重悬菌体，幼苗在子叶节点或近端下胚轴处注射2～3次，接种菌液，菌液注射后28℃暗培养24 h再用菌体侵染1次。将侵染后大豆幼苗放入含B&D营养液润湿蛭石中，蛭石覆盖伤口，保鲜膜覆盖培养钵。侵染3 d后观察愈合伤口，将突起下部约1 cm处剪断。生长2～3周后，将发根长度为5～10 cm移栽至B&D营养液水中，连续通气培养3～5 d。利用该方法快速获得复合植株（Composite plants），即转基因植株发根和非转基因地上部分[28-29]。

1.2.6 大豆根部总DNA提取

将水培阶段结束的每3株复合植株（为一组）置于高温灭菌土与细沙（1∶1）混合土中，同时用孵化出的二龄幼虫（J2）混制成2 000条·mL-1卵悬液侵染，保持湿润并在15 d后取其新鲜单株侧根3～4 cm于2 mL离心管中（加钢珠），迅速放入液氮冷冻，标准打样机捣碎侧根（2000DENO/GRINDER），利用SDS小量法提取大豆根部总DNA，保存于20μL去离子水中。所得大豆根部DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，利用全自动数码凝胶图像分析仪（TANON 3500）检测其浓度，-20℃冰箱保存备用。

1.2.7 酸性品红染色法染色根系内线虫

以PCR阳性的根植株为阳性对照，以PCR阴性的根植株为阴性对照，以转pCAMBIA3300为空白对照，鉴定大豆胞囊线虫抗性，采用国际常用酸性品红染色法鉴定[10]。

1.2.8 候选基因功能验证

提取转基因植株根部DNA，利用克隆引物PCR法检测转基因阳性根，PCR鉴定。将检测带有转基因阳性根植株及其对照作线虫卵悬液接种鉴定，15 d后采用酸性品红染色法，作大豆胞囊线虫病4号生理小种抗性鉴定。20×光学显微镜下计数，每株取11个侧根，计算每株雌虫平均数。

1.3 数据分析

采用Excel 2016对处理组和对照组作t测验。

2 结果与分析

2.1 GmRSCN4-3基因编码蛋白的生物信息学分析

通过 ProtParam tool（http://www.expasy.ch/toools/protparam.html）对GmRSCN4-3蛋白序列分析理化性质。结果表明，GmRSCN4-3基因编码669个氨基酸，分子式为C1984H3301N669O826S190，预测分子质量为55.83 ku，等电点PI为5.10，不稳定性指数为62.45，证明此蛋白为不稳定性蛋白；总负电荷基数（Asp+Glu）为0个，正电荷残基数（Arg+Lys）为0个，脂溶指数（Aliphatic index）为21.52；疏水性平均系数（GRAVY）为0.827。蛋白质氨基酸序列分析表明，GmRSCN4-3蛋白中含量最高为cys（28.4%），其次是gly（26.8%）。Hphob./Kyte&Doolittle算法（http://ca.expasy.org/tools/protscale.html）分析氨基酸序列亲水性与疏水性，其中负分值氨基酸少于正分值氨基酸，即亲水性小于疏水性，表明其为疏水性蛋白。

2.2 抗病候选基因GmRSCN4-3克隆和转化

2.2.1 东农L-10根部总RNA提取

选取接种线虫卵悬液12 h后东农L-10根部组织提取总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测，其中18S和28SRNA带型清晰可辨（见图1），经Nanovue超微量紫外分光光度计检测，总RNA中OD260/OD280比值为1.98，介于1.9～2.1，说明RNA完整性好、纯度高，适宜cDNA合成。

2.2.2 大豆抗胞囊线虫候选基因GmRSCN4-3 cDNA获得

以大豆东农L-10根部总RNA逆转录cDNA为模板，分别用GmRSCN4-F、GmRSCN4-R，经PCR扩增后产物得到特异性目的片段，长度500～750 bp，与预期片段700 bp一致（见图2）。将扩增所得目的片段与pCAMBIA3300植物过表达载体利用In-Fusion连接（见图3），转化至大肠杆菌DH5α，经菌液PCR验证（见图4），挑取5个阳性克隆送华大基因测序。以测序大豆品种Williams82 GmRSCN4-3序列信息设计引物扩增目的基因，将测序结果与NCBI公布序列比对，再将5个测序结果两两比对，最终选取与NCBI公布序列最接近且在测序结果中有两个以上完全匹配序列，确定为大豆东农L-10品种中GmRSCN4-3基因最终序列。

图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 Agarosegel electrophoriesis of total RNA

图2 目的基因扩增产物电泳结果Fig.2 Electrophoresis result of gene amplification products

图3 pCambia3300载体单酶切电泳Fig.3 Agarosegel electrophoriesis of p Cambia3300 vector single enzyme digestion

2.2.3 发根农杆菌阳性克隆鉴定

以含pCambia3300-GmRSCN4-3重组质粒发根农杆菌菌液为试材，使用Infusion克隆引物作PCR，对发根农杆菌作阳性克隆鉴定，结果表明6个不同单克隆菌液PCR产物均为阳性（见图5），表明pCambia3300-GmRSCN4-3基因成功转化。

2.3 转基因阳性根鉴定

对接种15 d后14株发根植株提取DNA，作克隆引物PCR鉴定（见图6），结果表明11株植株均表现为阳性。

2.4 转基因阳性根表型鉴定

将检测到标有转基因阳性根的11个植株及其对照处理在相同条件下接种鉴定，15 d后经酸性品红染色法20×光学显微镜下计数，每株取10个侧根，计算每株雌虫平均值（见表2），结果显示转基因阳性根中雌虫胞囊数显著低于对照。

图4 p Cambia3300-GmRSCN4-3转大肠杆菌PCR初步鉴定Fig.4 PCR results of Escherichia coli containing therecombinant plasmid p Cambia3300-GmRSCN4-3

图5 含p Cambia3300-GmRSCN4-3重组质粒发根农杆菌菌液PCR检测结果Fig.5 PCR results of Agrobacterium rhizogenes bacteria containing therecombinant plasmid p Cambia3300-GmRSCN4-3

图6 东农50发根植株阳性根PCR检测结果Fig.6 Positive root PCR results of Dongnong 50 root plant

表2 植株根部雌虫平均数Table2 Average number of female plant (个·cm-1)

3 讨论与结论

3.1 发根农杆菌介导大豆遗传转化

大豆R基因种类和数量众多，但有关抗SCN抗病候选基因较少，大豆胞囊线虫抗性基因功能鉴定通常采用永久遗传转化法，此方法验证抗病候选基因所需时间长，步骤繁琐且转化效率低，阻碍大豆胞囊线虫病候选基因鉴定效率[28]。发根农杆菌侵染子叶节或下胚轴从而诱导形成不定根，具有生长速度快、生长所需条件易控制、遗传稳定、发根数量多、转化效率高、生长条件简单、成本低等优点[29]。因此，发根农杆菌介导的大豆发根遗传转化成为大豆根部病害抗性基因理想研究系统。本研究利用发根农杆菌介导转化大豆方法，快速鉴定GmRSCN4-3基因对大豆胞囊线虫抗性，证明该系统有效性。

3.2 SCN抗性基因功能快速鉴定法-品红染色法

大豆胞囊线虫抗性鉴定方法主要包括根系酸性品红染色法和传统根系胞囊计数法。本研究采用根系酸性品红染色法作抗性鉴定[10]，与传统根系胞囊计数法相比，此方法有鉴定时间短、胞囊脱落少、计数准确等优点。因此本研究采用改进的发根农杆菌诱导毛状根法结合根系酸性品红染色法，可高效开展大豆胞囊线虫抗性候选基因功能验证。

3.3 抗大豆胞囊线虫候选基因功能验证

目前，我国已筛选出高抗大豆胞囊线虫病4号小种抗源多数为黑种皮地方品种，其抗源抗性多由显性抗病位点Rhg4控制，该基因与黑种皮基因i密切连锁[23-24]，利用这些抗源开展育种多采用多次回交方式。与以往抗源不同，本研究采用抗源为黄种皮东农L-10[31]，可直接应用于育种，同时本研究成功从抗病品种东农L-10中获得抗病候选基因GmRSCN4-3，初步验证抗性候选基因GmRSCN4-3具有抗大豆胞囊线虫病4号生理小种功能，为东农L-10分子辅助育种体系建立奠定抗性基因基础。本研究通过发根农杆菌作抗性基因GmRSCN4-3初步功能鉴定，为过表达技术和基因敲技术全面解析GmRSCN4-3基因功能提供新思路。