HPLC法测定桂龙咳喘宁片中桂皮醛的含量

罗晋萍 ，冯 贞，田 晨

（1.山西食品省药品检验所，山西太原030001； 2.山西省人民医院药剂科，山西太原030012）

桂龙咳喘宁片由桂枝、龙骨、半夏、白芍等11味中药材组成，具有止咳化痰、降气平喘之功效［1］。现行标准为国家食品药品监督管理局标准（试行）YBZ04372005、YBZ04542005、YBZ14922009、YBZ19442005。全国有四家企业生产，但四家企业的原本标准不仅处方及工艺有一定差异，而且标准、规格、限度亦均不统一。为统一并提高标准，我们对桂龙咳喘宁片中君药桂枝的活性成分桂皮醛进行了含量测定研究。桂枝含挥发油1.5%，其活性成分为桂皮醛、肉桂酸等，桂皮醛含量为85%［2］。目前市场桂枝药材的质量层次不齐，由于桂皮醛等挥发性成分的不稳定性，原料质量、生产环节以及贮藏过程等多种因素均会影响质量甚至疗效，因此对方中挥发性成分的含量控制十分必要。

1 仪器与试药

仪器：戴安Ultimate 3000高效液相色谱仪；Agilent 1200高效液相色谱仪；岛津20A高效液相色谱仪；紫外检测器；富士C18填料自装色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、迪马C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、菲罗门C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计。

试剂：甲醇为色谱纯（迪马公司），其余溶剂为分析纯。

对照品：桂皮醛对照品由中国食品药品检定研究院提供（含量测定用，批号110710-200212）。

样品分别由南宁市冠峰制药有限公司、大连天山药业有限公司、江西药都仁和制药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：为自装柱，日本富士C18填料，4.6 mm×250 mm，5 μm。

2.2 波长选择

以对照品桂皮醛在400 nm～210 nm处进行扫描，在290 nm波长处有最大吸收，故选择290 nm为检测波长（见图1）。柱温：室温；流速：1.0 mL/min。流动相：乙腈-水（45∶55）。

方法学考察测定样品选用江西药都仁和制药有限公司（100601批）。

图1 桂皮醛光谱扫描图

2.3 提取时间的考察

供试品制备采用超声处理方法，分别采用超声提取20、30、40 min进行考察，结果表明超声提取30 min时已提取完全，且节能省时（见表1）。

表1 提取时间考察数据一览表

2.4 对照品溶液的制备

精密称定桂皮醛对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液。

2.5 供试品溶液的制备

取除去包衣的样品20片，精密称定，研细，称取约0.5 g，精密称定。置棕色具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，置冰水浴中，超声处理（功率 250 W，频率 33 kHZ，）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。对照品溶液进样量10 μL，供试品溶液进样量 10～20 μL，进行测定。

2.6 专属性实验

取处方中缺桂枝药材的全部药味，按本品制法及供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液，按照上述方法进行测定，结果阴性样品无干扰，方法可行（见图2）。

2.7 精密度考察

精密吸取批号为100601的同一份供试品溶液，重复进样6次，结果见表2。

结果该方法精密度良好。

2.8 线性范围的考察

分别精密吸取桂皮醛对照品溶液（0.032 35 mg/mL），分别以 2、4、8、10、15、20、25、30 μL 注入高效液相色谱仪，测定其峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标绘制标准曲线，测得回归方程为：Y=171.2X-1.680，r=1.000 0，结果见表 3。结果桂皮醛在0.064 7～0.970 5 μg范围内，峰面积与进样量有良好的线性关系。

图2 专属性实验

表2 精密度考察

2.9 稳定性实验

取批号为100601的同一份供试品溶液，每间隔一定时间进样一次，桂皮醛峰面积测定结果见表4。结果供试品溶液在30 h内基本稳定。

2.10 重复性试验

取同批样品（批号100601），依法平行测定6份，分别计算桂皮醛的含量，结果见表5。结果方法的重复性良好。

表3 标准曲线数据表

表4 稳定性试验结果

表5 重复性试验

2.11 准确度试验 取批号为100601的样品约0.16、0.20、0.25 g，精密称定，分别精密加入对照品适量，按上述方法制备供试品溶液，依法测定，结果见表6。结果表明正文方法回收率良好，准确度好。

表6 加样回收率试验结果

2.12 耐用性实验 分别更换不同仪器：岛津2010、Agilent1200高效液相色谱仪；不同色谱柱：迪马、菲罗门ODS C18（4.6×250 mm，5 μm）柱。结果分离度良好。

2.13 样品测定

按正文拟定含量测定方法，分别对9批样品进行测定，结果见表7。测定结果表明，不同生产企业以及同企业不同批次间桂皮醛含量差异较大，可能与原料药材质量、工艺、包装材料以及贮藏条件等因素有关，故很有必要控制其质量，以保证其疗效。

表7 九批样品含量测定结果

3 讨 论

桂龙咳喘宁片原国家标准收载了肉桂酸的含量测定以及挥发性醚浸出物项来控制挥发性物质的质量，但在检验中发现，挥发性醚浸出物在检测时受环境（温度、湿度、以及挥干的时间等）因素影响过大，经方法学验证，精密度差导致测定结果偏差甚大，难以准确控制其质量，故我们在承担中国药典相关品种增修订起草研究任务时，删去了此项检测方法，而改用高效液相法测定桂枝的含量。由于当时条件所限，故选用了肉桂酸作为对照，但其主要的挥发性成分仍未得到有效控制。

桂皮醛为挥发性成分，具有镇痛、抗惊厥、解热等作用［3］，在检测肉桂酸含量时发现，桂皮醛吸收峰远远高于肉桂酸［4］，在方中起着重要作用。通过控制该指标，不仅可以有效控制桂枝的质量，而且对药品包装材料也提出更高的要求（如避光、密闭性等），从而确保该产品的稳定性以及在有效期内疗效的一致性。故控制桂皮醛更有意义。因此我们将原标准统一修订为HPLC法测定桂皮醛的含量测定［5-7］，该方法简便，快捷，并具有准确度、精密度、重现性好等特点，且分离度良好，阴性无干扰，通过此检测手段能客观地控制和评价桂龙咳喘宁片的质量。目前《中国药典》2015年版一部中的桂枝、肉桂药材的含量测定指标亦为桂皮醛，对于控制此类药材起到十分有效的作用。

因桂皮醛遇光不稳定，因此实验操作时尽可能在暗室进行，或采取其他避光措施，确保测定过程不因环境因素影响检测结果。

提取方式的选择：因桂皮醛的热不稳定性，故未考虑回流和索氏提取的热处理方法，而是采用超声提取的方法。

提取时间的选择：因桂皮醛的易挥发性，时间太短提取不完全，而超声提取时间过长，会造成超声仪水温升高，导致桂皮醛挥散逸失使含量下降，因此采用冰水浴中控制温度。分别考察超声提取20、30、40 min，结果以提取30 min最佳。

我们曾对处方中含有桂枝、肉桂一类成药进行含量考察时发现，即便在有效期内，随着贮藏时间的延长桂皮醛含量下降较为明显，常温下放置一年的样品含量甚至出现低于标准规定限度。因此要求在制定标准时，应对企业生产的近、中、远期产品均要进行考察，使其能全面代表该产品质量情况。还需要生产企业考虑改善包装材料，实现很好的避光、密闭性。同时还需控制运输及贮藏条件，确保产品的质量及有效性。

桂枝原料的选用非常重要，中国药典2015年版规定桂枝药材为肉桂的嫩枝，且粗端直径为0.3～1 cm。我们在考察桂枝原料时发现，直径与含量成反相关，直径细者含量较高，直径粗者含量较低，因此生产企业投料时应严格控制原料药材的质量，确实选用嫩枝，而非市场上常见的粗细混杂情况，否则难以确保质量。