聚酰胺树脂分离构树皮总黄酮及其抗菌活性初步探讨

开伟华 ，张五七 ，周 青 ，查 诚 ，程 正

（1.铜陵职业技术学院，安徽铜陵244000； 2.铜陵市食品药品检验中心，安徽铜陵244000）

浅部真菌病是指由真菌引起的表皮角质层、毛发、甲板等组织的感染，是最常见的一种感染性皮肤病。目前人们正不断研究高效、低毒、广谱的抗真菌新药，从植物中寻找抗真菌药物，已成为药物研究的热点。构树皮为构树的茎皮，其性味甘平，具有清热凉血、利湿祛痰等功效，可用治咳嗽气喘、水肿、血崩、跌打损伤等疾病。研究发现，构树皮对浅部真菌具有较强的抑制作用［1］。构树皮含有大量的黄酮类、二苯丙烷类以及香豆素、萜类、生物碱、脂肪油等成分，黄酮类成分是构树皮多种化学成分中的主要成分，因黄酮类化合物富含酚羟基，可与聚酰胺分子中的酰胺基形成氢键缔合产生吸附，因此，本实验采用聚酰胺树脂分离纯化总黄酮化合物，筛选聚酰胺树脂精制构树皮总黄酮的最优工艺，并对构树皮的抑菌作用进行初步探索。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），电子分析天平（Shimadzu），旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司），鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），聚酰胺树脂（60～100目，西亚试剂），槲皮素对照品（98%，Sigma Aldrich），硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠试剂均为分析纯（上海国药集团化学试剂）。构树皮采集于安徽铜陵，经铜陵市食品药品检验所管大平鉴定为桑科构属植物构树Broussonetia papyrifera的茎皮。采回的构树皮经除杂、洗净和晾干后粉碎，过20目筛，置塑封袋中，备用。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线绘制 按照前期研究方法，取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解定容，摇匀，制成0.1mg/mL槲皮素对照品溶液备用，精密量取槲皮素液 0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分别置10 mL具塞试管中，分别加1%三氯化铝-甲醇溶液1 mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min，以不加槲皮素标准液为空白，在270 nm波长下测定吸光度［1］，得出标准曲线A=0.021 C-0.000 8，r=0.999 7，说明槲皮素含量在0～50 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。

1.2.2 提取液的制备 参照前期成果，取构树皮粉末10.0 g，以10倍体积70%乙醇冷浸，超声20 min，功率300 W，滤过，合并滤液，减压回收溶剂浓缩至干，得构树皮粗提物，取适量精密称定，加甲醇溶解，摇匀，配成10 mg/mL构树皮粗提液，精密量取1.0mL加1%三氯化铝甲醇溶液1 mL，摇匀，放置显色15 min后，由回归方程求出构树皮总黄酮类化合物浓度，并算出构树皮总黄酮提取率为2.21%［1］。

1.2.3 聚酰胺树脂的预处理 取聚酰胺树脂用95%乙醇浸泡24 h，使之充分溶胀，倾去乙醇漂浮物后，用蒸馏水洗至无醇味，再用0.25 mol/L NaOH浸泡24 h，滤掉上层碱液，以蒸馏水洗至中性后，用体积分数为10%醋酸（体积为水相的4倍）浸泡 24 h，用蒸馏水洗至中性，备用［2］。

1.2.4 上样浓度和饱和吸附量考察 取聚酰胺树脂5份，每份50 g，分别置层析柱中，柱体积50mL（1BV），分别加入 10 mg/mL，20 mg/mL，40 mg/mL，60 mg/mL和80 mg/mL的构树皮粗提物溶液，上样速度为1 BV/h，以三氯化铝显色检测黄酮类成分，直至有黄酮成分泄露，记录不同浓度的粗提物上样体积，计算饱和吸附量，以饱和吸附量较大的上样浓度为最佳上样浓度。

吸附率（g/g树脂）=饱和吸附量／聚酰胺树脂量

1.2.5 洗脱溶剂体系考察 取聚酰胺树脂50 g，置层析柱中，柱体积50 mL，分别加入2.4项下优选出上样浓度构树皮粗提物溶液，充分吸附后，依次以3 BV的水、30%、60%和100%乙醇洗脱，洗脱流速为1 BV/h，洗脱液蒸干，以三氯化铝显色测定总黄酮含量，计算洗脱率、总黄酮质量分数和总黄酮回收率。

总黄酮质量分数（%）=［洗脱部位黄酮重量／洗脱部位总重量］×100%

总黄酮回收率（%）=［洗脱部位黄酮重量／（构树皮粗提物浓度×上样体积）］×100%

1.2.6 洗脱流速考察 取聚酰胺树脂3份，每份50 g，分别置层析柱中，柱体积50 mL，按照2.4项下优选出的构树皮粗提物最佳浓度上样，以三氯化铝显色检测黄酮类成分，直至有黄酮类成分泄露，静态吸附3～4 h，分别以1.2.5项下确定的最佳溶剂洗脱，以流速为1 BV/h、2 BV/h和3 BV/h进行洗脱，计算黄酮类成分的洗脱率、总黄酮质量分数和总黄酮回收率。

1.2.7 聚酰胺树脂重复使用周期数［3］称取聚酰胺树脂50 g，将构树皮粗提取液按最佳工艺条件上样，充分吸附后，用蒸馏水洗至流出液为无色后，用

1.2.5项下最佳溶剂洗脱，1.2.6项下最佳流速进行洗脱，收集洗脱液，为1个周期，重复10个周期，分别计算每个周期中黄酮的质量分数和回收率。

1.2.8 聚酰胺树脂分离构树皮总黄酮体外抑菌作用实验 选用红色毛癣菌和絮状表皮癣菌，用平皿药基法，沙堡琼脂为基础培养基，取构树皮粗提取液按优选出的最佳条件进行上样，充分吸附后，用蒸馏水洗至流出液为无色后，按最佳条件进行洗脱，收集洗脱液，蒸干。取构树皮浓缩提取物0.1 g溶于水置100 mL量瓶中，用灭菌蒸馏水稀释至刻度，精密量取药液0.1 mL加入8 mL琼脂培养中混匀，用灭菌蒸馏水稀释成不同浓度，以基础和溶剂培养基为对照，用菌悬液法配成相当于0.5麦氏度的菌悬液备用，接种，培养温度（25±1）℃，培养1 w观测抑菌效果。

2 结 果

2.1 上样浓度和饱和吸附量考察结果

使用不同浓度的构树皮粗提物上样后，聚酰胺树脂的饱和吸附量有差异，以40 mg/mL和60 mg/mL浓度上样，树脂吸附量最大；而使用粗提物40 mg/mL浓度上样所需溶液体积较60 mg/mL大，上样耗时长，因此，优选构树皮粗提物溶液60 mg/mL浓度上样。结果见表1。

2.2 洗脱体系考察结果

根据2.1项下实验结果，取浓度60 mg/mL的构树皮粗提物溶液75 mL，以50 mL/h流速上样，充分吸附4 h，依次以水和不同体积分数的乙醇溶液进行洗脱，分别测定其总黄酮含量，计算洗脱率、总黄酮质量分数和回收率，结果见表2。

表1 上样浓度和饱和吸附量考察结果

表2 洗脱体系考察结果

由表2可以看出，采用梯度洗脱法，用30%乙醇洗脱，杂质的洗脱率最大，再用60%乙醇洗脱，总黄酮类质量分数和回收率最大。因此，可先用水和30%乙醇进行洗脱，除去大量的水溶性杂质，此时总黄酮仅损失率为5.03%，再用60%乙醇进行洗脱，总黄酮质量分数达到59.23%，回收率达77.43%。

2.3 洗脱流速考察结果

根据2.1项下实验结果，取60 mg/mL的构树皮粗提物溶液75 mL，以50 mL/h流速上样，静态吸附4 h，依次以水和30%乙醇除杂，继续以1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h的60%乙醇洗脱3个柱体积，分别测定60%乙醇洗脱部位中的总黄酮含量，计算洗脱率、总黄酮质量分数和回收率。结果见表3。

表3 上样浓度和饱和吸附量考察结果

由表3可见，当洗脱流速从1 BV/V到3 BV/V，洗脱量稍有增加，但洗脱的总黄酮量下降，可能由于聚酰胺与黄酮类成分以氢键吸附，流速较快时解吸附不够，使总黄酮洗脱量下降，进而洗脱产物中总黄酮质量分数和回收率降低。所以在洗脱时，以1 BV/h流速洗脱较好。

2.4 聚酰胺树脂重复使用周期考察

取聚酰胺树脂50 g，取60 mg/mL的构树皮粗提物溶液75 mL，以50 mL/h流速上样，充分吸附4 h，用蒸馏水洗至流出液为无色后，用60%乙醇，流速1 BV/V进行洗脱，重复洗脱10个周期，结果见图1。

由图1可知，随着洗脱聚酰胺树脂周期数增多，洗脱后总黄酮的质量分数和回收率都降低，且洗脱到第4个周期后，总黄酮质量分数和回收率下降较显著，因此反复洗脱聚酰胺树脂使用3～4个周期为宜，其后应当进行再生处理或更换。

图1 聚酰胺树脂重复使用周期考察

2.5 验证实验

取构树皮粉末10.0 g，以10倍体积70%乙醇冷浸，超声20 min，功率300 W，滤过，合并滤液，减压回收溶剂浓缩至干，得构树皮粗提物，配成60 mg/mL的构树皮粗提物取溶液，取75 mL以50 mL/h流速上样，充分吸附4 h，用蒸馏水洗至流出液为无色后，用60%乙醇，流速1 BV/V进行洗脱，重复洗脱3个周期，蒸干，测得总黄酮质量分数平值为58.78%，总黄酮平均回收率为76.21%，总黄酮平均含量为3.74%。

2.6 构树皮总黄酮体外抑菌实验

构树皮总黄酮体外抑菌作用实验结果见表4，构树皮提取浓缩物对红色毛癣菌和絮状表皮癣菌均有一定的抑制作用，在1∶320的浓度上对絮状表皮癣菌无抑制作用，在1∶640浓度上对红色毛癣菌和絮状表皮癣菌均无抑制作用。

表4 构树皮提取浓缩物水溶液的抑菌作用

从构树皮提取物的平板菌落计数结果分析，以真菌未生长的药物培养基最低药物浓度为该样品对该菌的最低抑菌浓度（MIC），以v/v换算成含生药浓度为g/1 000 mL，得出构树皮提取物水溶液对红色毛毛癣菌和絮状表皮癣菌的MIC分别为0.52 g/1 000 mL和1.06 g/1 000 mL。

3 讨论

浅部真菌主要为皮肤丝状菌，侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织引起癣症，又称癣菌，是皮肤科临床最常见的皮肤病。其中，手足癣、体癣、股癣及甲癣的病原菌以红色毛癣菌最常见，其次为絮状表皮癣菌等。构树皮抑菌作用主要活性成分为黄酮类化合物，本实验采用聚酰胺树脂富集［4-5］构树皮粗提物中总黄酮，其含量达58.78%，比前期实验中用大孔树脂富集总黄酮含量［6］明显提高，且对红色毛癣菌和絮状表皮癣菌抑菌效果显著，所以用聚酰胺对构树皮黄酮类的富集效果往往优于大孔吸附树脂［7］。而构树皮资源丰富，有可能开发出新的抗真菌中药，并为抗真菌提供可靠的手段。