酶法酿造沙棘荞麦醋工艺研究

陈卫锋，徐升运，秦涛，赵文娟，李文孝

(1.陕西省生物农业研究所，西安 710043；2.陕西省酶工程技术研究中心，西安 710043)

沙棘是一种多年生的灌木，属于胡颓子科(Elaeagnaceae)，沙棘属(HippophaeLinn)。沙棘具有良好的生态保护作用，比如保持水土、防风固沙、改良土壤和适应性强等，同时沙棘含有丰富的生物活性物质如氨基酸、脂肪酸、黄酮等，因此，沙棘具有较高的营养和药用价值[1]。荞麦是我国北方重要的杂粮作物之一，其微量元素和黄酮类等活性物质含量丰富[2]。以沙棘和荞麦为原料，辅以现代生物技术(酶工程的应用)生产沙棘荞麦醋，既保证了两种原料中的营养成分完全释放，又有效利用了两种原料各自的优点。我国虽然已经有荞麦醋的酿造，但是利用沙棘秆、沙棘果皮为辅料酿造沙棘荞麦醋还未见报道，本研究以荞麦粉为碳源，利用酶工程技术以及发酵技术将其中的淀粉转化为醋酸的同时，又利用酶工程技术对沙棘辅料进行破壁，使其中的活性保健成分最大程度地释放，酿造出具有较高保健功能的功能型食醋。本文对酿造工艺中的酶工程技术以及酿造工艺进行了探索，并确定了基本工艺参数，为沙棘荞麦醋的产业化提供了指导。

1 材料与方法

1.1 菌种

酿酒酵母：购自安琪集团；醋酸菌：购自广东省微生物研究所。

1.2 材料

沙棘原料：包括沙棘秆、沙棘果皮、沙棘果泥、沙棘果汁，由陕西省延安市吴起县园方集团提供；荞麦粉：购自陕西省定边县；纤维素酶：陕西省生物农业所生产；糖化酶：购自山东济宁和美生物工程有限公司；果胶酶：天津诺奥科技有限公司。

1.3 培养基

麦芽汁培养基；醋酸菌菌种培养基。

1.4 主要仪器

恒温培养箱、高压灭菌锅、超净工作台、细胞破碎仪、721紫外分光光度计等。

1.5 分析方法

总酸(以醋酸计)含量的测定：GB/T 12456-2008[3]。

淀粉含量的测定：GB 5009.9-2016《食品中淀粉的测定》[4]。

还原糖含量的测定：GB 5009.7-2016 《食品中还原糖的测定》[5]。

总黄酮含量的测定：紫外分光光度法[6]。

2 工艺参数确定的试验方法

2.1 工艺流程

利用酶法糖化，改变传统的小酒母发酵制作酒曲的方法。在利用沙棘辅料时加入纤维素酶和果胶酶，有助于有效活性成分的释放。工艺流程图见图1。

图1 工艺流程图Fig.1 Process flow diagram

2.2 糖化工艺的优化

称取100 g荞麦粉置于500 mL三角瓶内，定量加入水，调节pH值，加入糖化酶，保温糖化。以淀粉含量和还原糖含量计算水解率，考察最佳糖化条件。根据糖化条件的单因素试验结果，以糖化酶用量、处理温度、处理时间作为考察因素，设计L9(33)正交优化试验，从而获得最佳糖化工艺。

2.3 沙棘原料酶处理条件的优化

沙棘原料包括：沙棘秆、沙棘叶、沙棘果皮、沙棘果泥、沙棘果汁。针对这些沙棘原料主要成分，选择对应的水解酶进行酶处理，达到沙棘原料中沙棘黄酮以及沙棘多糖和一些沙棘特有维生素和微量元素充分释放的目的，以期提高沙棘荞麦醋的营养保健功效。

本试验采用纤维素酶、果胶酶进行酶解处理。以酶解温度、酶解pH、酶用量和酶作用时间作为单因素，研究这4个因素对沙棘黄酮含量的影响，在酶作用单因素试验的基础上，设计L9(34)正交试验，从而获得酶处理沙棘原料的最佳工艺参数。

3 结果与分析

3.1 糖化条件的优化结果

分别选取糖化酶酶解温度、酶解时间、加酶量这3个因素及其对应的3个较优水平进行正交试验，在酶液pH为6.0的条件下，用正交试验对酶解工艺条件做进一步优化，正交试验结果见表1。

表1 糖化酶酶解正交试验结果Table 1 Orthogonal experiment results of saccharifying enzyme enzymolysis

由表1可知，影响荞麦淀粉酶法水解的因素顺序为：酶解温度>酶添加量>酶解时间，最佳水解条件应为：酶解温度50 ℃，酶加入量20 U/g，酶解时间90 min。

3.2 沙棘原料酶处理条件优化单因素试验结果

3.2.1 酶添加量对总黄酮得率的影响

在温度为45 ℃，酶解时间为90 min，原料和水比例为1∶25(W/V)，酶液质量分数为0.1%～0.2%时，考察酶添加量对黄酮得率的影响，结果见图2。

图2 酶添加量对黄酮得率的影响Fig.2 Influence of enzyme additive amount on flavonoids yield

由图2可知，在酶浓度为0.1%～0.5%时，黄酮得率随着酶添加量的增加而提高，当酶添加量超过0.3%以后，黄酮得率提高不显著，因此，最佳酶用量为0.3%。

3.2.2 酶作用时间对黄酮得率的影响

固定酶添加量为0.3%，酶作用时间为30～150 min, 其余条件同3.2.1，酶作用时间对黄酮得率的影响见图3。

图3 酶作用时间对黄酮得率的影响Fig.3 Influence of enzymatic time on flavonoids yield

由图3可知，随着酶作用时间的延长，黄酮得率不断提高，当酶解时间达到120 min后，黄酮得率提高不显著。这是因为随着酶解时间的增加，沙棘原料中细胞壁的纤维素及细胞间的果胶质被酶降解，有利于黄酮从细胞内溶出。

3.2.3 酶作用温度对黄酮得率的影响

酶作用时间定为120 min，酶解温度设为35～65 ℃，其他各条件同3.2.2。黄酮得率变化见图4。

图4 酶作用温度对黄酮得率的影响Fig.4 Influence of enzymatic temperature on flavonoids yield

由图4可知，温度过低，不利于酶的作用发挥，温度过高抑制酶活，50 ℃左右是该酶制剂的最适作用温度，确定最佳温度为50 ℃。

3.2.4 pH对黄酮得率的影响

在酶添加量、作用时间、温度单因素试验的基础上，设计pH在4.5～7.0之间，考察pH变化对黄酮得率的影响，结果见图5。

图5 pH对黄酮得率的影响Fig.5 Influence of pH values on flavonoids yield

由图5可知，pH为6.0时黄酮得率最高。因为酶作用都有最适pH值，当pH值过低或过高时都不利用酶的催化作用。

3.3 最佳工艺条件的确定

3.3.1 正交试验

在单因素试验的基础上，设计正交试验，见表2。

表2 正交试验设计Table 2 Orthogonal experiment design

3.3.2 正交试验结果

以总黄酮得率为指标，采用L9(34)来确定最佳工艺条件，见表3。

表3 正交试验表Table 3 Orthogonal experiment table

由表3可知，酶添加量、作用时间、作用温度和pH值对黄酮得率影响的顺序为：作用温度>酶添加量>作用时间=pH值，最佳条件应为A2B3C2D1。综合考虑单因素结果，确定最佳参数为：A2B2C2D2，即酶加入量为0.3%，作用时间为120 min，作用温度为50 ℃，pH值为6.0。

沙棘黄酮的药理作用主要有抗心肌缺血、改善心肌细胞功能、抗心律失常、改善心肌肥大、抗血栓形成、降血糖、提高免疫、抗氧化、抗癌、抗过敏、抑菌等[7]。在发酵生产荞麦醋时，本研究应用酶工程技术工艺提高了游离黄酮含量，改善了荞麦醋的功能，酿造出具有保健功能的醋产品。

4 结论

在酿造沙棘荞麦醋中荞麦粉的糖化工艺上，影响糖化效果的因素主次为：酶解温度、酶添加量、酶解时间，得到荞麦粉糖化的最佳工艺条件为：酶解温度为50 ℃，酶加入量为20 U/g，酶解时间为90 min。

复合酶作用沙棘原料的最佳工艺条件为：酶添加量0.3%，酶解时间120 min，酶作用温度50 ℃，pH 6.0。

现代生物技术酶法酿造沙棘荞麦醋，作用条件温和，保护了沙棘、荞麦中的营养物质活性，且荞麦与沙棘原料中的主要活性成分总黄酮的利用率提高，增强了沙棘荞麦醋的保健功能，开发出了功能性食醋及醋饮产品，其市场前景广阔。