青、红花椒提取物体外抗氧化性质分析

陈静，陈志宏，张汆*，张玉龙

(1.滁州职业技术学院 食品与环境工程系，安徽 滁州 239000；2.滁州学院 生物与食品工程学院，安徽 滁州 239000)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)，又称为山椒，芸香科植物，是一种重要的香辛料，具有增香去腥的作用，在食品加工中应用广泛[1]。花椒中含有花椒挥发油、生物碱、黄酮、植物甾醇、多糖以及维生素等多种生物活性物质，有一定的防腐抑菌、抗氧化、提高免疫力、抗感染、抗溃疡、抗肿瘤等功效[2-4]。花椒可分为青椒和红椒2种，青椒多产自南方，而红椒在北方居多。2种花椒不仅在外观上有较大差异，在风味和组分方面也有一定差别[5]。

花椒中富含各种挥发油、黄酮和多酚等生理活性组分，对这些组分的分离提取也是目前研究的主要内容之一。花椒中提取的挥发油对3种肿瘤细胞生长都表现出抑制作用，显示出一定的体外抗肿瘤活性[6]。此外，花椒挥发油对人HePG2肝癌细胞也具有一定的杀伤力[7]。不同溶剂提取的花椒精油在颜色和气味等方面有明显差异，乙醚提取精油表现出最强的抗菌活性[8]。宋丽雅等[9]研究发现花椒中提取的有效成分对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等微生物均表现出较好的抑菌活性。狄科等[10]研究发现，采用丙酮提取的花椒多酚具有较好的DPPH·清除能力。花椒水提物可有效抑制小鼠胃溃疡，醚提物对盐酸性大鼠胃溃疡的形成有一定抑制作用[11]。

以青、红花椒为研究对象，分别采用水、50%乙醇和无水乙醇作为提取溶剂制备花椒提取物，对这2种花椒提取物的体外抗氧化性质进行了分析和比较，通过研究，为花椒作为肉制品天然保鲜剂的应用提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器设备

1.1.1 材料

青花椒(藤椒)、红花椒(汉源)：均购于四川。2种花椒样品经干燥后粉碎(过40目筛)，即得青花椒粉和红花椒粉。

1.1.2 仪器设备

中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；RE-85Z旋转蒸发器 郑州凯鹏实验仪器有限公司；KQ-100DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；LGJ-10B真空冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；721E型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.1.3 试验试剂

铁氰化钾、三氯化铁(CR)、亚油酸、抗坏血酸、吐温-20(CR)、硫氰酸铵、无水对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、无水乙醇、亚硝酸钠等试剂：均为分析纯，购自国药集团(上海)化学试剂公司；DPPH·(1,1-二苯基-2-苦肼基自由基，1,1-Dipheny1-2-Picrylhydrazyl Free Radical)：纯度>97.0%，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 花椒提取物制备

无水乙醇提取物(简称为E-100)的制备：分别称取20 g青、红花椒粉于烧杯中，加入100 mL无水乙醇溶解，超声波辅助浸提30 min后抽滤，残渣用无水乙醇重复提取1次，合并提取液，真空浓缩后冷冻干燥，即得花椒无水乙醇提取物。

50%乙醇提取物(简称为E-50)的制备：于乙醇提取后的残渣中加入100 mL 50%乙醇水溶液，重复上述提取流程，所得提取液浓缩后冷冻干燥，即得花椒50%乙醇提取物。

水提取物(简称为E-W)的制备：50%乙醇水溶液提取后的残渣中加入100 mL水，重复上述提取流程，所得提取液浓缩后冷冻干燥，即得花椒水提取物[12]。

1.2.2 总还原力的测定

将花椒提取物分别配制成0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mg/mL的溶液。准确吸取各溶液2.5 mL于试管内，分别加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6.6)和1%铁氰化钾溶液，50 ℃水浴保温20 min后迅速冷却，之后再加2.5 mL 10%醋酸溶液，3000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，依次加2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀，静置10 min，于700 nm处测定其吸光度值A。按照上述方法同时测定不同浓度的抗坏血酸(VC)溶液总还原力[13，14]。不同浓度下VC溶液总还原力的测定同上。

1.2.3 DPPH·清除能力的测定

将花椒提取物分别配制成0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的溶液。取2支试管，1支加1.0 mL0.2 mmol/L DPPH·-乙醇溶液，另1支加1.0 mL0.2 mmol/L DPPH·-乙醇溶液和0.2 mL样品溶液，用无水乙醇定容至5.0 mL。室温避光静置30 min后在517 nm处测定吸光值，分别记作A0和A1，各样品平行测定3次后取平均值[15-17]。样品溶液的DPPH·清除率计算公式为：

清除率(%)=(1-A1/A0)×100。

不同浓度下VC溶液DPPH·清除能力的测定同上。

1.2.4 脂质过氧化抑制能力测定

将花椒提取物分别配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的溶液。准确吸取0.5 mL溶液，与2.5 mL亚油酸乳化液混匀，暗处于37 ℃水浴内保温24 h，反应后得氧化液。取氧化液0.1 mL，加0.9 mL去离子水，依次加5 mL 75%甲醇溶液，1.0 mL 30%硫氰酸铵溶液和0.02 mol/L硫酸亚铁溶液，静置5 min，于510 nm波长处测定其吸光度值A1。以蒸馏水代替样品同方法测定吸光值A0[18]。

样品溶液脂质过氧化抑制率计算公式：

IR(%)=(1-A1/A0)×100。

式中：IR为抑制率，%；A1为样品溶液吸光值；A0为对照溶液吸光值。

不同浓度下VC溶液脂质过氧化抑制能力测定同上。

1.2.5 不同时间条件下样品抗脂质过氧化活性研究

取脂质过氧化抑制能力较强的样品配制成1.0 mg/mL样品溶液，按照上述方法分别测定反应4，8，12，24，26，28，29，30 h时的脂质过氧化抑制率，研究不同时间条件下样品抗脂质过氧化活性[19]。

1.2.6 对NO2-的清除作用

将花椒提取物分别配制成0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL的样品溶液。准确吸取5 μg/mL NaNO2溶液2 mL于50 mL容量瓶中，加5 mL样品溶液反应10 min，再加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置4 min，加1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，用蒸馏水定容至50 mL，静置15 min后于538 nm处测吸光度值[20]，为A1。以蒸馏水代替样品同样方法测定吸光值得A0。

样品溶液对NO2-的清除率计算公式为：

清除率(%)=(1-A1/A0)×100。

式中：A1为加入样品溶液时的吸光度值；A0为空白溶液的吸光度值。

不同浓度下VC溶液NO2-的清除率测定同上。

1.2.7 数据处理方法

所有样品均重复测定3次，最终结果以平均值±标准差表示。采用Excel数据分析软件对试验结果进行处理及图表绘制。

2 结果与分析

2.1 青、红花椒提取物感官特性

6种青、红花椒提取物的感官性状见表1。青、红花椒无水乙醇提取物带有花椒特有风味且颜色较深，呈粘稠状。相比之下，其他2种提取物均为粉末状，50%乙醇提取物的颜色和气味要比水提取物更浓。原因可能与花椒中特征风味物质和色素多为脂溶性成分而易溶于乙醇有关。

表1 青、红花椒提取物感官特性Table 1 The sensory properties of green and red peppers' extracts

2.2 总还原能力

总还原力是物质体外抗氧化活性的一个重要指标，主要通过检验样品是否为很好的电子供体，且其供应的电子不仅可以还原三价铁离子，同时还可以参与自由基反应，使其生成稳定的物质。不同浓度下，青、红花椒提取物的总还原力结果见图1。

图1 青、红花椒提取物总还原力Fig.1 The total reduction capacities of green and red peppers' extracts

由图1可知，随着溶液浓度的增加，6种青、红花椒提取物的总还原力呈现不同程度的增强趋势。在0.3～0.7 mg/mL范围内，GE-50还原能力最强，其次是RE-100和RE-50，RE-W还原能力最弱，GE-100和GE-W还原能力比较接近，稍高于RE-W。随浓度增加，GE-100、GE-W和RE-50的总还原力变化幅度较低，其他3种变幅较大，呈现较明显的剂量效应。

2.3 DPPH·清除活性

不同浓度条件下，青、红花椒提取物的DPPH·清除率见图2。

图2 青、红花椒提取物DPPH·清除率Fig.2 The DPPH· elimination rates of green and red peppers' extracts

由图2可知，在0.5～2.5 mg/mL浓度范围内，6种青、红花椒提取物DPPH·清除率均随浓度增加呈现不同程度的增加趋势。其中，RE-100显示出最高的清除效果，在0.5 mg/mL时即达到80%的清除效果。其次是GE-50和RE-50，在1.5 mg/mL时均接近90%。GE-W DPPH·清除率随浓度增加变化最大，当浓度在2.5 mg/mL时达到最高，明显高于RE-W和GE-100。

2.4 脂质过氧化抑制活性

脂质过氧化是自由基产生和参与的链式反应，每一步都会有自由基中间产物的产生及参与。亚油酸是油脂中较常见的一种多不饱和脂肪酸，易发生氧化，常用来衡量物质的体外抗氧化活性。不同浓度下，青、红花椒提取物对脂质过氧化的抑制效果见图3。

图3 青、红花椒提取物脂质过氧化抑制活性Fig.3 The lipid peroxidation inhibitory activities of green and red peppers' extracts

由图3可知，在0.2～1.0 mg/mL浓度范围内，6种青、红花椒提取物均显示出较高的脂质过氧化抑制活性，且均随浓度增加而增大。在浓度为0.2 mg/mL时，其抑制率也在62%～76%之间。RE-W 和GE-50的脂质过氧化抑制活性较低，其余4种相对较高，且在浓度1.0 mg/mL时，变化趋于平稳，且比较接近，达到最高值，均在94%以上，其中GE-W抑制率最高。

2.5 抗脂质过氧化动力学

1.0 mg/mL GE-W对脂质过氧化抑制活性随时间的变化趋势见图4。

图4 不同时间内青花椒水提取物脂质过氧化抑制率Fig.4 The lipid peroxidation inhibitory rates of green peppers' extracts under different time

由图4可知，随着时间延长，提取物的脂质过氧化抑制活性不是固定不变的，呈现明显的增强趋势，且呈现明显的3个阶段。在0～12 h内，提取物对脂质过氧化的抑制活性呈线性增加；在12～24 h之间，其抑制率变化平缓；24 h以后又有较明显的增加。以上3个阶段的形成，可能是由于在开始阶段，样品中抗氧化组分浓度较高，对脂质过氧化的抑制速度增加较快；随着反应的进行，抗氧化组分逐渐消耗或饱和，致使其抑制活性增幅缓慢；之后的明显增加，可能与体系中具有抗氧化活性的中间物质的生成有关，具体原因还有待分析。

2.6 对NO2-的清除活性

亚硝酸盐(NO2-)可使血液载氧能力下降，从而导致一些疾病。另外，亚硝酸盐摄入人体后可与体内胺类物质结合，形成强致癌物N-亚硝基化合物，因此，具有清除NO2-活性的物质被认为具有降低食品中NO2-含量，从而显示一定的抗癌作用。所以，通常也将NO2-清除能力作为衡量物质体外抗氧化活性的一个重要指标。不同浓度下，青、红花椒提取物对NO2-的清除活性见图5。

图5 青、红花椒提取物对NO2-的清除活性Fig.5 The NO2-elimination activities of green and red peppers' extracts

由图5可知，在0.05～0.25 mg/mL的浓度范围内，6种青、红花椒提取物均显示出较高的NO2-清除活性，且清除率随浓度增大而增加。其中，在0.05 mg/L时，GE-50清除率最低，随浓度增加，清除率明显增加，并逐渐趋于平缓。其余5种提取物在较低浓度(0.05 mg/mL)下即显示出较高的NO2-清除活性(67%～76%)，且不同提取物之间差异较小，以RE-100和GE-100的清除率最高。

2.7 不同提取物的体外抗氧化能力比较

维生素C(VC)是膳食中普遍存在的一种水溶性维生素，也是食品中公认的天然高效抗氧化组分。以LC50值为衡量标准，不同青、红花椒提取物与VC的抗氧化作用见表2和表3。

表2 青、红花椒提取物体外抗氧化活性LC50值Table 2 The LC50 values of antioxidant activities in vitro of green and red peppers' extracts

注：LC50是指发挥50%体外抗氧化活性时的样品溶液浓度，mg/mL。

表3 不同浓度Vc溶液体外抗氧化活性分析Table 3 The antioxidant activities analysis in vitro of Vc solution with different concentration

与Vc溶液相比，6种提取物显示出良好的脂质过氧化抑制能力和NO2-清除能力，远高于Vc，RE-100的DPPH·清除率也优于Vc，但是总还原力均小于Vc。不同提取物之间，总还原力最高的是GE-50，其次是RE-100，最低的是RE-W。DPPH·清除效果，以RE-100最强，其次是GE-50和RE-50，最小的是2种水提取物。对脂质过氧化的抑制能力以GE-100和GE-W最强，对NO2-的清除效果以GE-100最好。

3 结论

分别采用无水乙醇、50%乙醇和蒸馏水从青、红花椒中获得6种花椒提取物，并对其体外抗氧化活性进行了分析比较。结果显示：不同花椒提取物具有很强的体外抗氧化能力，且呈现不同程度的量效关系。与天然抗氧化剂VC相比，6种提取物显示出良好的脂质过氧化抑制能力和NO2-清除能力，RE-100的DPPH·清除率也优于VC，但是总还原力均小于VC。不同提取物之间，总还原力最高的是GE-50，其次是RE-100，最低的是RE-W。DPPH·清除效果，以RE-100最强，其次是GE-50和RE-50，最小的是2种水提取物。对脂质过氧化的抑制能力以GE-100和GE-W最强，对NO2-的清除效果以GE-100最好。以上结果表明:青、红花椒提取物抗氧化作用存在明显差异。2种花椒提取物具有非常优良的体外抗氧化活性，尤其是在抑制脂质过氧化和清除NO2-方面，远高于VC，在含脂食品的防腐保鲜方面显示出很好的应用前景。