郫县豆瓣黄曲霉毒素B1污染状况及季节变化分析

徐炜桢

(1.西华大学 生物工程学院 食品生物技术四川省高校重点实验室，成都 610039；2.四川省丹丹郫县豆瓣股份有限公司，成都 611732； 3.四川友联味业食品有限公司，成都 611732)

黄曲霉毒素是最常见的一类真菌毒素，是黄色曲霉菌或寄生曲霉菌在生长繁殖过程中产生的一组有毒代谢产物，在自然界中广泛存在，尤其对玉米[1]、大米[2]、花生[3]、辣椒[4]和豆类发酵食品[5]等造成污染。黄曲霉毒素是次生代谢产物，主要对人类和动物的RNA和DNA的合成进行干扰，当RNA和DNA不能进行合成时会导致细胞蛋白质合成受阻，最后使得动物基因突变，产生致癌物[6]，常见的黄曲霉毒素有B1，B2，G1，G2，M1 5种，其中B1为毒性及致癌、致畸和致突变最强的物质，是一种毒性最强的天然物质。黄曲霉毒素Bl(AFB1)的半数致死量为0.36 mg/kg体重，砒霜的半数致死量是14.6 mg/kg体重，比砒霜大68倍，是一种剧毒物质，损害人和动物的肝脏，造成人和动物代谢系统的紊乱，引起肝细胞坏死、肝硬化，诱发肝癌、胃癌等，严重的引起人和动物恶心、呕吐、死亡等[7]。

郫县豆瓣属中国传统发酵食品，迄今为止已有300多年的历史，具有味辣香醇、红棕油亮、粒稠绒实、酱香浓郁的特点，是烹饪川菜必不可少的调味品，在世界发酵辣椒酱中别具一格，它在选材上与工艺上与众不同，可谓是“川菜之魂”[8,9]。郫县豆瓣产业是郫县重要的支柱产业之一，其产业总量已经占中餐总量的35%以上，郫县豆瓣每年销售额逐年增加，1999年开始，郫县豆瓣销售总量达到5万吨，销售收入总额为5万吨，销售总收入为2.5亿元；在2010年，郫县豆瓣销售总量达到45万吨，销售总收入为18亿元；到2015年末，郫县豆瓣销售总量达到110万吨，销售总收入为102亿元[10]。

郫县豆瓣在发酵过程中分为发酵制曲阶段、发酵初期、发酵后期3个阶段[11]。制曲阶段主要是通过米曲霉等菌种在原料上生长繁殖，利用它们分泌蛋白酶、肽酶、淀粉酶、糖化酶等多种酶类，是豆瓣生产中最重要的质量控制点[12]；发酵初期阶段(10～60天)是将曲瓣子与盐水按比列混合发酵，制成成熟瓣子(甜瓣子)；发酵后期(60～240天)是先制好甜瓣子，然后将甜瓣子和辣椒按一定比例混合均匀搅拌，随后加入食盐和水进行搅拌，倒入发酵池进行发酵，经过一段时间的不断翻晒和陈化[13]。因为传统发酵生产豆瓣处于比较粗放的境况：第一，生产用菌不同程度地产生黄曲霉毒素；第二，由于生产所用的米曲霉、黑曲霉等与黄曲霉的生化条件相近，控制不严极易被杂菌污染，产生黄曲霉毒素[14]；第三，在郫县豆瓣发酵的管理过程中很难避免AFB1的污染，而在烹饪过程中也不能将AFB1去除[15]，常出现AFB1超过国家标准限量的问题，带来食品质量安全隐患。目前，AFB1对食品污染的问题已引起了全国的高度重视，并开展了广泛的研究，取得了显著的成果，且各国根据各自的国情制定不同食品及动物饲料中AFB1限量标准，控制或降低AFB1污染对人群健康造成的危害。

为初步了解成都市郫县豆瓣中AFB1的污染状况，制定控制措施，提高监管水平，降低风险。我们从不同渠道采集郫县豆瓣样品共296批次，在春夏季节和秋冬季节分别为124批次和172批次，对一整年郫县豆瓣中AFB1进行测定污染情况，然后再分别对秋冬季节郫县豆瓣中AFB1和春夏季节郫县豆瓣中AFB1含量进行测定，通过春夏季节与秋冬季节中AFB1含量的变化及比较，来思考季节温差对郫县豆瓣中AFB1的影响，以期为郫县豆瓣的食品安全监管提供可靠依据，为制定郫县豆瓣中AFB1控制措施提供科学合理的根据。

1 材料与方法

1.1 原料采集

在春夏季节：在春夏季节共取样124批次，分别来自四川大型企业合计47批次；大型商场(红光世纪百盛购物广场、步步高郫县红光店、红旗连锁、蜀都万达永辉超市)合计19批次；农贸市场(犀浦农贸市场、青白江成刚菜市场、红光农贸市场、志阳农贸市场)合计41批次；红光镇批发市场合计17批次。

在秋冬季节：在秋冬季节共取样172批次，分别来自四川大型企业合计88批次；大型商场(红光世纪百盛购物广场、步步高郫县红光店、红旗连锁、蜀都万达永辉超市)合计23批次；农贸市场(犀浦农贸市场、青白江成刚菜市场、红光农贸市场、志阳农贸市场)合计44批次；红光镇批发市场合计17批次。

1.2 试剂

甲醇(分析纯，西陇科学股份有限公司)、石油醚、三氯甲烷(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)、抗黄曲霉毒素B1(AFB1)抗体酶结合物：1瓶(6 mL)ELISA kit(德国R-Biopharm公司)、显色液A:1瓶(6 mL)、显色液B:1瓶(6 mL)、终止液：1瓶(6 mL)，2 mol/L硫酸、样本稀释液：1瓶、浓缩洗涤液：1瓶、黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品：6瓶(1 mL/瓶)，含量分别是：0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2 μg/L。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取郫县豆瓣样品30 g左右，研磨至均匀糊状后放入保鲜袋中密封保存放入冰箱中备用。

1.3.2 黄曲霉毒素B1提取

提取方法根据国标方法改进[16]，将研磨好的豆瓣从冰箱中取出先在室温中放置30 min，准确称取豆瓣15 g，加入到250 mL锥形瓶中，然后加入50.0 mL甲醇-水溶液和15 mL石油醚盖塞，密封后放入摇床，在150 r/min条件下振荡30 min，等待摇床停止后，用快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，静止5 min，放出下层溶液至烧杯中，从中取20 mL置于另一分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，振荡2 min后等待静置分层，然后放出下层的三氯甲烷于蒸发皿中，再在分液漏斗中加入10 mL三氯甲烷摇晃振荡2 min，等待分层后放出下层三氯甲烷于蒸发皿中，将蒸发皿放在70 ℃水浴中挥干，挥干后加入3 mL甲醇溶液，溶解凝结物，将溶液移置试管中保存。

1.3.3 检测方法

测量方法依据试剂盒说明书上面的方法进行测定，具体如下：取适量微孔板固定在板架上面放于桌面上，先依次加入50 μL标准品溶液，再顺序加入50 μL样品溶液，最后在所有具有溶液的孔中加入50 μL抗黄曲霉毒素B1(AFB1)抗体酶结合物，轻轻晃动几秒钟使之混合均匀，置于37 ℃水浴锅中30 min，在此过程中不时地将板架取出来轻轻地拍打晃动，目的是使之充分混合均匀减少双孔误差；水浴结束后，取出孔板甩掉孔中溶液，用洗涤液洗涤微孔板4～5次，最后在吸水纸上拍打除去孔中液体。

1.3.4 反应

洗涤完成甩掉孔中溶液后，在微孔中加入50 μL显色液A，再加入50 μL显色液B，轻轻晃动反应板使之彻底混合均匀，再放于37 ℃水浴锅中水浴10 min，最后在每个孔中加入50 μL终止液。

1.3.5 检测

待反应完成后在450 nm下检测吸光度。

1.4 数据处理

测得的标准溶液和样品溶液的吸光值取平均值，除以第一个标准(0标准)的吸光值的平均值再乘以100%，即百分吸光度，设为Y轴；以黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度对数值为X轴，根据标准品测得百分吸光度Y轴与标准品黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度对数值X轴的线性关系，绘制标准曲线图，再根据样品的百分吸光度值，可以从标准曲线得到对应的横坐标，即样品中黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度的对数值，然后求其反对数即为样品溶液中的黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度c(μg/L)。样品中黄曲霉毒素B1含量为：

式中：X为样品中所含黄曲霉毒素B1含量；c为在标准曲线中每个样品的百分吸光度值所对应的浓度对数值；k为豆瓣样品加水稀释的倍数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制及总体情况

将系列AFB1标准品溶液(0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2 μg/kg)测得吸光度值，绘制AFB1的标准曲线(见图1)，以黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度对数值为X轴，百分吸光度为Y轴，得到线性方程y=-0.5121x+0.6728，R2=0.99，可知，标准方程的R2在0.99以上，说明在给定的测量条件下标准曲线的线性良好。

图1 AFB1的标准曲线Fig.1 Standard curve of AFB1

2.2 不同来源郫县豆瓣样品中黄曲霉毒素B1的污染情况

表1 不同来源郫县豆瓣样品中AFB1的污染情况Table 1 The pollution of AFB1 in the sample of Pixian soybean paste from different sources

注：“ND”表示低于检测限(0.2 μg/kg)。

由表1可知，AFB1污染情况差异较大，AFB1污染严重程度依次为(由大到小排序)农贸市场(3.915 μg/kg)>批发市场(3.495 μg/kg)>大型商超(3.153 μg/kg)>重点企业(2.749 μg/kg)；农贸市场的最高值(7.119 μg/kg)与最低值(2.487 μg/kg)均高于其他3个地方的最高值和最低值，大型商超、批发市场、重点企业合格率均高于平均合格率，只有农贸市场合格率较低，说明农贸市场是AFB1污染最严重的，并且农贸市场中郫县豆瓣产品给消费者带来的食品安全风险较大，监管部门应该作为重点监管对象，另外，对于消费者来说长期使用含有AFB1含量偏高的豆瓣，对健康有严重的危害的，严重的可以引起肝损伤，以至癌变，所以消费者应尽量选择重点企业或者大型商超的豆瓣；同时，从郫县豆瓣整体来看，合格率在94.60%，一共抽样296个样品，就有16个不合格，超过我国在GB 2761-2011《食品安全国家标准 食物中真菌毒素限量标准》中规定黄曲霉毒素B1的限量，其中黄曲霉毒素在发酵豆瓣中的限量不得超过 5 μg/kg。说明AFB1污染郫县豆瓣总体形势不容乐观，在豆瓣中存在安全隐患，监管部门应进一步加强发酵豆瓣中AFB1的防治、检测与管理。

2.3 不同季节郫县豆瓣样品中黄曲霉毒素B1的污染情况

表2 不同季节郫县豆瓣样品中AFB1的污染情况Table 2 The pollution of AFB1 in the sample of Pixian soybean paste in different seasons

注：“ND”表示低于检测限(0.2 μg/kg)。

春、夏季，我们从四川大型企业、农贸市场、大型商超、批发市场等地分别采集样品共124个，在这124个样品中，一共检测了120个样品，检出率为96.77%。AFB1超过国家标准限量5.0 μg/kg的样品共有9个，产品合格率达92.74%。

秋、冬季，我们从四川大型企业、农贸市场、大型商超、批发市场等地分别采集样品共172个，在这172个样品中，一共检测了170个样品，检出率为98.88%。AFB1超过国家标准限量5.0 μg/kg的样品共有6个，产品合格率达96.47%。

在秋冬季节豆瓣中AFB1的平均含量为3.057 μg/kg，在春夏季节豆瓣中AFB1的平均含量为3.566 μg/kg，秋冬季节最高值(6.475 μg/kg)小于春夏季节最高值(7.119 μg/kg)，秋冬季节AFB1合格率为96.47%，春夏季节AFB1合格率为92.74%；可以得出在秋冬季节豆瓣中AFB1污染情况均比在春夏季节豆瓣中AFB1的污染情况小，季节对郫县豆瓣中AFB1的污染有一定的影响，在秋冬季节比在春夏季节污染情况要低。

3 讨论与结论

从一年的总体情况来看，郫县豆瓣中黄曲霉毒素B1的合格率为94.60%，大型商超、批发市场、重点企业的合格率均高于平均合格率，只有农贸市场的合格率较低，所以可以看出郫县豆瓣受AFB1的污染总体情况良好，只有农贸市场的情况不容乐观。

对于春夏季节与秋冬季节郫县豆瓣中AFB1含量的差异，秋冬季节时郫县豆瓣中AFB1的合格率明显低于春夏季节时郫县豆瓣中AFB1的合格率；在秋冬季节测定AFB1的平均值含量明显低于在春夏季节测定AFB1的含量；在秋冬季节AFB1最高值、最低值都低于春夏季节AFB1含量。因为黄曲霉毒素主要由寄生曲霉和产毒黄曲霉分泌产生的有毒次生代谢物，由于春夏季节和秋冬季节的温差变化，造成酶的活性不同，并且黄曲霉菌生长繁殖及其在天然基质中产生黄曲霉毒素所需要的最低相对湿度为14%左右，所需最适宜的温度为25～30 ℃[17]，水分含量超过10%，非常容易造成黄曲霉毒素的污染和毒素积累，所以在秋冬季节湿度和温度较低，而在春夏季节湿度和温度都较高，适应AFB1的生长，所以导致AFB1的含量有差异。可以得出季节对郫县豆瓣中寄生曲霉和产毒黄曲霉分泌产生的黄曲霉毒素有一定的影响，食品安全监管应该把春夏季节作为检查的重点，生产厂家也可以根据季节来控制减少AFB1的污染，给消费者带来食品安全的保障[18]。

加强对AFB1的防治措施从两个方面进行，一是预防，二是处理降低AFB1。预防郫县豆瓣受污染的途径应当包括生产豆瓣的原料、生产和存储全过程；处理降低AFB1的方法有碱处理法、氧化处理法、吸附剂脱毒、高温处理法、黄曲霉毒素生物降解、微生物代谢产物降解黄曲霉毒素[19]。而本研究通过对一整年豆瓣中AFB1污染情况的调查，比较春夏季节和秋冬季节豆瓣中AFB1含量的不同，分析了我市郫县豆瓣在不同季节AFB1含量的总体状况，为建立我市郫县豆瓣中黄曲霉毒素B1的应急对策与预警体系提供了基础数据，让我们思考可以从不同的季节对豆瓣进行发酵生产，来降低AFB1的污染，也可以通过温度来控制AFB1的产生，为我国对发酵豆瓣中防治AFB1提供新思路。