襄阳大头菜不同发酵状态腌制液中细菌多样性分析

赵慧君，葛东颖，刘倩，吴竞，凌霞，张振东，郭壮*

(1.湖北文理学院 化学工程与食品科学学院 鄂西北传统发酵食品研究所，湖北 襄阳 441053；2.襄阳市食品药品检验所，湖北 襄阳 441021)

襄阳大头菜历史悠久，相传为诸葛亮隐居襄阳隆中时所创，是我国四大名腌菜之一。在襄阳大头菜发酵过程中，有些腌制池或缸表面会形成一层白色的生物膜，造成大头菜的脆度明显降低且产生刺激性气味。一般认为，这层白色的生物膜是由微生物群体和包裹菌体的基质组成的聚合物[1]。近年来，对于引起发酵蔬菜腐败的微生物研究也卓有成效，特别是在泡菜中的研究。蔡炯等发现细菌和酵母是四川腐败泡菜中的主要微生物[2]。王猛等发现四川泡菜腐败前后盐浓度越低细菌多样性越高[3]。何鹏晖等发现了 6株能够在发酵蔬菜培养液表面形成膜醭的细菌，可能为发酵蔬菜形成腐败膜醭的关键细菌和潜在威胁[4]。胡怀容等推断芽孢杆菌和酵母可能是引起腌制大头菜腐败变质的主要原因[5]。陈岑研究也证明芽孢杆菌可以引起泡菜的腐败[6]。敖晓琳等也从不同的“生花”泡菜中分离出 4株细菌和 4 株酵母回接实验证明这8株菌均能引起泡菜不同程度的腐败[7]。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)是近几年来在环境分子生态学研究中运用非常多的一项技术。PCR-DGGE 最先由德国的Muyzer等应用于微生态的研究，用这种方法能检测出数量仅占总群落 1% 的微生物。Danilo 等曾运用 16S rRNA V3区扩增片段结合 DGGE 技术，对 21 株参考菌株和分离自食品中的 34 株乳酸菌分别进行了分析研究，并提出该方法可以用于食品中乳酸菌的分类。Ana Belén Flórez 等用 PCR-DGGE 技术和经典分离鉴定方法对 4 批意大利传统发酵干酪不同成熟阶段的微生物多样性进行了系统的研究，用 DGGE 发现了纯培养未曾发现的细菌。PCR-DGGE也广泛应用于传统发酵类食品微生物群落结构及其差异性，例如不同来源的郫县豆瓣酱、不同原料四川泡菜、水果泡菜、印度尼西亚的扇贝等[8-14]。

目前还没有针对襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜腌制液中细菌微生物多样性比较的研究。本研究利用 PCR-DGGE 技术对不同发酵状态下的襄阳大头菜腌制液中的细菌多样性进行了分析，研究了细菌对大头菜长膜腌制液的贡献，为后续襄阳大头菜的工业化和标准化生产提供了一定的基础，也可为其他腌菜类似的问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

聚丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酰胺：国药集团化学试剂有限公司；D5625-01DNA提取试剂盒(Omega)、DNA Marker(Fermentas)、PCR清洁试剂盒(AXYGEN)：购于北京科博汇智生物科技发展有限公司；2×PCR mix：购于南京诺唯赞生物科技有限公司；rTaq、dNTP、pMD-18-T-Verctor：购于大连宝生物技术有限公司(TaKaRa)；PCR引物合成和测序：由武汉天一辉远生物科技有限公司完成。

1.1.2 仪器与设备

冷冻离心机 美国Beckman公司；PCR仪 美国Thermo Fisher公司；变性梯度凝胶电泳系统 美国Bio Red公司；电泳仪 北京六一仪器厂；凝胶成像仪 美国Protein Simple公司；扫描仪 上海中晶科技有限公司。

1.1.3 实验样品

本实验所用材料采集于襄阳孔明菜食品有限公司。分别在10个正常发酵大头菜池和10个长膜的大头菜池里采集腌制液和生物膜，采集后低温保存，带回实验室进行后续实验。

1.2 实验方法

1.2.1 宏基因组DNA的提取与检测

采用Omega D5625-01试剂盒提取2种大头菜腌制液10个样品的宏基因组DNA，其中大头菜长膜腌制液是将膜和腌制液充分混匀后进行DNA提取，并用0.8%琼脂糖凝胶进行检测。

1.2.2 PCR

将提取的宏基因组浓度调整一致后作为模板进行 PCR 扩增。正向引物为 ALL-GC-V3F(5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACCGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')，反向引物为ALL-V3R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')[15]，PCR扩增体系为2.5 μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，2 μL dNTP(2.5 mol/L)，0.5 μL ALL-GC-V3F(10 mmol/L)，0.5 μL ALL-V3R(10 mmol/L)，0.5 μL rTaq(5 U/μL)，1 μL DNA模板，18 μL无菌水。PCR反应条件：95 ℃ 4 min预变性，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃延伸 10 min。PCR扩增结束后，取扩增产物5 μL用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 DGGE及数据分析

采用变性剂线性梯度为 27%～60%，浓度为 8%(W/V)的聚丙烯酰胺浓度(40%丙烯酰胺/N,N-亚甲基二丙烯酰胺，W/W)凝胶进行电泳，PCR扩增产物上样量为 10 μL。电泳时，温度为 60 ℃，先 120 V，78 min；后80 V，13 h。电泳结束对聚丙烯酰胺凝胶进行银染，用扫描仪采集凝胶电泳图片，并用Quantity One 软件分析图片。

1.2.4 DGGE条带的切割、克隆及测序

将DGGE胶上的优势条带进行切割后，用50 μL无菌水浸泡过夜后作为模板，用不含GC 夹子的引物进行扩增，扩增程序同上。扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳进行检测并用 PCR 清洁试剂盒进行清洁，然后与 T-载体连接后转化到大肠杆菌 TOP10 中，待长出单菌落后鉴定阳性克隆，并将阳性克隆送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。

1.2.5 测序产物的比对及进化树的构建

将测序结果除去两端载体的序列，然后利用 NCBI Blast 从 GenBank 数据库中提取相似度比较高的相似的序列，用 MEGA 4.0 软件制作系统发育树，采 Neighbor-joining(邻位相连法)制作系统进化树[16]，利用 Bootstrap(自展法)检测制作的系统树[17]，自展数据集为 1000 次。

2 结果与分析

2.1 大头菜腌制液中细菌16S rRNA V3区域扩增产物DGGE图谱分析

大头菜正常腌制液和长膜腌制液的DNA提取成功后，进行细菌16S rRNA V3区域扩增，扩增片段大小180 bp左右，且无非特异性扩增，可以用于DGGE。不同发酵状态 10 个正常发酵大头菜腌制液样品(N-1～N-10)和10个长膜大头菜腌制液样品(M-1～M-10)16S rRNA 扩增产物的 DGGE 结果见图1。

图1 襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜腌制液的细菌 DGGE 图谱Fig.1 DGGE chromatogram of bacteria in normal fermentation and biomembrane Xiangyang mustard root

DGGE图谱中条带的数量反映样品中微生物的多样性，条带的亮度在一定程度上能反映菌种数量的多少。可以看出20个样品经DGGE后都分离出清晰的电泳条带，说明电泳条件比较适合。由图1可知，不同样品间条带几乎没有差异，只有编号4，5，6 的条带在大头菜长膜腌制液的M-1，M-2，M-3，M-4，M-9和M-10样品中亮度有所增加。

2.2 DGGE图谱聚类分析

不同样品间共有条带数目的多少可以反映样品间微生物群落结构的相似性，采用 UPGMA 对样品间微生物群落结构进行相似性评估。大头菜正常腌制液和长膜腌制液的细菌聚类分析见图 2。

图2 襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜腌制液的细菌聚类分析Fig.2 The cluster analysis of bacteria in normal fermentation and biomembrane Xiangyang mustard root

由图2可知，初步将 20 个大头菜腌制液样品分为两类，每类中大头菜正常发酵腌制液与长膜腌制液均混杂其中，可见分类与大头菜的腌制液是否长膜并无太大关系。由此推断，细菌并不是引起大头菜长膜的主要因素。

2.3 DGGE条带测序及同源性分析

对DGGE图谱上的代表性亮带进行切胶、扩增、克隆和测序，结果见表1。与NCBI上的模式菌株进行比对并构建进化树，结果见图3。共对12个条带进行了测序，条带对应图1中的编号。

表1 襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜腌制液的细菌 DGGE 条带比对结果Table 1 Blast results of DGGE in normal fermentation and biomembrane Xiangyang mustard root

注：编号对应图1中的编号。

由表1可知，除1外，其余条带的相似性与 NCBI中序列的相似性均在 99%～100%之间，说明鉴定具有意义。

图3 基于16S rRNA构建的襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜腌制液中细菌系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of normal fermentation and biomembrane Xiangyang mustard root

由图1可知，编号为11的条带为襄阳大头菜卤水中最具优势的菌株，测序结果为盐单胞菌属的细菌，可在含盐0～32%的培养基上生长，这与襄阳大头菜腌制液中的高盐环境是相一致的。从测序结果看，条带7，8也为盐单胞菌属的细菌，由此可见，盐单胞菌属的细菌在大头菜腌制液中细菌微生物中占绝对优势。4，5，6 3个条带在长膜的腌制液中亮度有所增加，从它们的测序结果看关于这3个菌属还没有腐败相关的报道。

3 讨论

郭壮等利用 MiSeq 测序研究了襄阳大头菜腌制液膜醭细菌群落结构，发现优势菌株为Halomonas属，Halanaerobim属和Chromohalobacter属细菌，这3种细菌占细菌总数量的50%以上[18]。本研究利用DGGE分析不同大头菜不同发酵状态的腌制液中细菌的多样性，测序的12个条带中有8个属于这3个菌属，说明这与MiSeq测序结果是一致的。这3个菌属的细菌是腌制蔬菜中常见的和优势的菌属。

本研究通过 DGGE 比较了襄阳大头菜正常发酵腌制液与长膜腌制液中细菌的异同，发现二者在细菌种类上基本相同，推测细菌不是引起襄阳大头菜腌制液长膜的主要原因。在泡菜中的研究表明，细菌和真菌都可能造成发酵液中长膜，所以下一步的研究方向是揭示真菌对襄阳大头菜长膜的贡献。