儿茶素对食醋总酚、色率、风味及晚期糖基化产物的影响

罗庆，李艳丽，唐诗淼，陈媛媛，周梦舟，冯年捷，吴茜*

(1.湖北工业大学 生物工程与食品学院，武汉 430068；2．三峡食品药品检验检测中心，湖北 宜昌 443005；3.湖北工业大学 材料与化学学院，武汉 430068)

近年来，对食品加工中美拉德反应的研究已经变得热门[1]。在食物的烹饪加热过程中美拉德反应对食品的色泽和风味具有很大的影响，同时还有着负面作用，最不可忽视的是使蛋白质的营养价值降低[2]。食醋中含有大量美拉德反应所需的底物，同时生产过程中也具备了美拉德反应所需的条件[3]，美拉德反应可能也是醋液香味和色泽的一个重要来源。抗氧化剂有很好的清除自由基和抑制AGEs的能力[4]，从而减缓美拉德反应，而儿茶素作为一种优良的天然抗氧化剂，具有细胞调节和预防癌症等多种功效[5]。

美拉德反应主要指羰基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)之间的反应[6]，其终产物之一是晚期糖基化终产物(AGEs)。蛋白质糖基化产生AGEs的病理作用已被许多研究报道[7]，AGEs不仅可以直接影响细胞和组织功能，参与糖尿病并发症、老化过程及动脉粥样硬化等疾病的发生发展，也可以通过与受体特异性结合，激发信号通路转导来改变蛋白质和细胞功能，从而导致病变[8]。

本文探究了儿茶素对不同种类食醋在不同时间段的总酚、色率、AGEs抑制率和食醋内挥发性成分的变化，间接评估了儿茶素减缓美拉德反应发生的程度，为防止食醋在储藏过程中有害物质的增加和提高食醋品质安全奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同食醋原样(白醋、米醋、苹果醋、橘子醋、西瓜醋、魔芋醋、固态发酵醋)：购于淘宝天猫超市；福林酚试剂：上海源叶生物科技有限公司；琥珀酸、碳酸钠、甘氨酸、木糖、二辛醇：国药集团化学试剂有限公司；没食子酸：五峰赤诚生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计 北京瑞丽分析仪器有限公司；AR323CN型电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司；pH计 雷磁-上海仪电科学仪器股份有限公司；F-7000型荧光分光光度计 日立高新技术有限公司；7200型安捷伦气相色谱/四级杆飞行时间质谱仪 上海百贺仪器科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 不同食醋样品和模拟醋样的制备

取8组5 mL不同食醋样分别加入到15 mL的离心管中，分别加入浓度为0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL的儿茶素1 mL，并用蒸馏水代替儿茶素为对照组，摇匀，放置于50 ℃恒温培养箱。

准确称取甘氨酸6.0056 g和木糖12.0104 g(摩尔比为1∶1)，分别用pH为3.5的琥珀酸缓冲液定容至100 mL，准确称取儿茶素100 mg，琥珀酸缓冲液定容至100 mL,配制成儿茶素浓度为1.0 mg/mL。根据需要梯度稀释成浓度为0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.01 mg/mL的儿茶素溶液，取0.8 mol/L的甘氨酸4 mL，0.8 mol/L的木糖4 mL，加入2 mL儿茶素溶液，配制成10 mL的反应液，设置pH为3.5的琥珀酸缓冲液替代儿茶素作为对照组，摇匀，放置于50 ℃。

1.3.2 总酚的测定

标准曲线的绘制：准确称取一水合没食子酸0.100 g，用蒸馏水溶解后冷却定容至100 mL容量瓶中备用，此标准溶液浓度即为1000 mg/L。用移液管分别从此标准溶液中吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0 mL到50 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容后分别得到0，10，20，30，40，50 μg/mL的系列标准溶液。依次量取系列稀释后的标准溶液各0.5 mL，然后加入稀释5倍的福林酚试剂5 mL的水，摇匀，静置3 min，依次加入15%的碳酸钠2 mL，加入蒸馏水定容至10 mL，避光显色1 h后，在760 nm的波长下测定系列标准溶液的吸光度，绘制标准曲线[9]。得总酚的标准曲线为y=9.1143x+0.0416，R2=0.9984。

量取稀释若干倍的样液0.5 mL，按照制作标准曲线的方法依次加样，避光显色1 h后，在760 nm的波长下测定样品溶液的吸光值。

1.3.3 色率的测定[10]

将待测醋液离心后(4000 r/min，10 min)得澄清醋液，将其稀释5倍，取适量移入1 cm的石英比色皿中，用分光光度计于610 nm处测定其光密度值，以蒸馏水作为空白，按下式计算EBC色率，其中EBC意义在于：当610 nm处光密度为0.076时，设定为20000 EBC单位。

注：A610 nm表示样品在波长为610 nm处的吸光度。

1.3.4 AGEs抑制率的测定

AGEs大多具有荧光性，可通过荧光法检测其含量。激发波长370 nm，发射波长440 nm，分别测定真实醋样和模拟醋样稀释20倍后，相同温度50 ℃下，放置2，5，10，15天的各个样液中的荧光强度的变化值以及添加不同浓度的儿茶素后的抑制率。

1.3.5 食醋中挥发性物质的测定

1.3.5.1 样品预处理

先将萃取头装入手柄，插入250 ℃气相色谱进样口老化40 min至无杂峰。分别将醋样用无菌蒸馏水稀释到酸度为4 g，统一酸度。称取10 mL原醋样和10 mL醋样与儿茶素的混合液(体积比为9∶1)，儿茶素浓度为0.2 mg/mL，加入到20 mL顶空微萃取样品瓶中，放入转子，加入40 μL提前配好的二辛醇稀释液，盖上盖子，插入萃取头，固定在50 ℃磁力搅拌恒温水浴锅内，平衡20 min后推下纤维头继续萃取20 min，然后收起纤维头，拔下萃取头，插入气相色谱质谱联用仪的气相色谱进样口，推下纤维头，于250 ℃解吸4 min，抽回纤维头后拔出萃取头，同时启动仪器采集数。

1.3.5.2 仪器条件[11]

色谱条件：色谱柱，DB-WAX毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；通入保护气氦气(He)；流速：0.9 mL/min；进样口温度：250 ℃，不分流。程序柱温：起始温度40 ℃，5 min。阶段一：以4 ℃/min升温至120 ℃，运行25 min。阶段二：以8 ℃/min升温至200 ℃，保持5 min，运行40 min后至260 ℃。

质谱条件：电子离子(electronionization，EI)；接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，质量扫描范围33～450 amu。

2 结果与分析

2.1 不同浓度儿茶素对食醋中总酚含量的影响

以不加儿茶素的原醋样作对照组，随着所添加儿茶素浓度的增大，不同品种的食醋中总酚的含量均会增大；随放置天数的增加，白醋、苹果醋等6种醋样中总酚含量变化不太明显，固态发酵醋原样变化最为明显[12，13]，在50 ℃条件下放置2天后，其总酚含量从0.335 mg/mL增长到1.107 mg/mL，且2天后，随着放置天数的增加，固态发酵醋中的总酚含量增长减缓。由于发酵方式的不同[14]，固态发酵填充物(例如麸皮)中含有些许多酚、黄酮、VE等具有抗氧化功效的成分，这些物质在醋酸发酵的过程中被溶出，增强其抗氧化活性，这与罗秀丽等人的研究成果一致[15]。不同食醋中添加不同浓度的儿茶素的总酚测定结果见表1。

表1 不同浓度的儿茶素对不同食醋中总酚含量的影响

续 表

2.2 不同浓度儿茶素对食醋中色率的影响

酱油、食醋等发酵制品在发酵过程中会发生美拉德反应，颜色会加深[16]。由表1可知，白醋、米醋、苹果醋使用方法1.3.3测定的值较小，说明以上3组醋液在放置的过程中发生的美拉德反应程度较弱，加入不同浓度的儿茶素后，对其美拉德反应抑制效果不明显，且部分醋液运用方法1.3.3难以准确检测其美拉德反应发生程度。从橘子醋、西瓜醋、魔芋醋和固态发酵醋的数据可以看出，随着放置天数的增加，原样醋中的色率会增加，这说明醋液在50 ℃下能够加速其美拉德反应的发生。

表2 不同浓度儿茶素对不同食醋中色率值的影响

续 表

注：ND表示未检出。

由表2可知，随着不同浓度儿茶素的加入，加入了儿茶素的醋样中的色率值远小于原样值，这说明加入了儿茶素的醋样中美拉德反应的发生程度减弱，同时，通过色率的测定，可以得出儿茶素能够抑制美拉德反应的产生，且随着加入的儿茶素浓度的增大，抑制效果越好。

2.3 不同浓度儿茶素对AGEs的抑制效果

2.3.1 不同浓度儿茶素对模拟醋液中AGEs的抑制效果

不同浓度儿茶素添加到模拟醋液中，对其荧光性AGEs的抑制率的影响，见图1。

图1 不同浓度儿茶素对模拟醋液中AGEs的抑制率变化

在相同的放置温度下，随着儿茶素浓度的增加，相对抑制率亦增加；随着放置天数的增加，相对抑制率亦增加。对比参照2.3.2中数据可以看出，放置相同的温度和时间，在添加相同浓度的儿茶素的条件下，模拟醋液的抑制效果均高于真实醋液。这说明按醋液中还原糖和氨基氮配制的醋液模拟液在50 ℃条件下，能较大程度发生美拉德反应，产生晚期糖基化终末产物；间接说明真实醋液中可能存在能够加速美拉德反应的因子，即在真实醋液中美拉德反应更容易发生。

2.3.2 不同浓度儿茶素对真实食醋样中AGEs的抑制效果

图2 不同浓度儿茶素对白醋中AGEs的抑制率变化

图3 不同浓度儿茶素对米醋中AGEs的抑制率变化

图4 不同浓度儿茶素对苹果醋中AGEs的抑制率变化

图5 不同浓度儿茶素对橘子醋中AGEs的抑制率变化

图6 不同浓度儿茶素对西瓜醋中AGEs的抑制率变化

图7 不同浓度儿茶素对魔芋醋中AGEs的抑制率变化

图8 不同浓度儿茶素对固态发酵醋中AGEs的抑制率变化

由图2～图8可知不同浓度的儿茶素对不同种类的食醋中荧光性AGEs的抑制效果。在相同的放置温度(50 ℃)下，随着儿茶素浓度的增加，每种食醋中的相对抑制率亦增加。随着放置天数的增加，各个浓度的儿茶素对食醋中荧光性AGEs的抑制效果增加。白醋、米醋等4种醋样在添加浓度为0.8，1.0 mg/mL的儿茶素后，放置10，15天后对食醋中荧光性AGEs的抑制效果达到了90%左右；部分食醋在放置10天后，抑制率开始有些许的下降，这是由于放置过程中食醋样品发生了返浑的现象[17]。返浑可能造成的原因有生物性返浑(主要有嗜酸耐热芽孢杆菌属、葡萄杆菌属等)和非生物性返浑(非生物因素有蛋白质、还原糖和单宁等)，这些因素会加剧美拉德发生的发生。

2.4 不同浓度儿茶素对食醋中挥发性物质的影响

表3 GC-MS分析儿茶素对橘子醋中挥发性成分的影响

续 表

注：ND表示未检出。

由表3可知，从橘子醋原样液中共鉴定出了21种成分，即酸类5种、醇类3种、酯类4种、醛类1种、酮类1种、其他物质7种；从橘子醋与儿茶素的混合液中共鉴定出22种成分，即酸类4种、醇类4种、酯类3种、醛类2种、酮类1种、其他物质8种。测定的2组样液中均含有的酸类有3种(乙酸、异戊酸、琥珀酸)、醇类2种(乙醇、3-丁炔-1-醇)、酯类2种(2-甲基丁基乙酸酯、乙酸苯乙酯)、其他物质4种(三甲基吡嗪、庚烷、甲酰肼、二甲酰肼)，其中添加儿茶素组中的乙酸含量为37.658%，大于原醋样中30.196%的乙酸含量，说明儿茶素的添加可能促进食醋中乙酸的生成；随着儿茶素的添加，食醋中酯类物质均增加，其中2-甲基丁基乙酸酯的含量由4.326%增长至14.027%，乙酸苯乙酯的含量由0.238%增长至0.541%，而酯类物质是醋液中挥发性香味成分的主要来源[18]，包括乙酸异戊酯、乙酸乙酯、苯甲酸乙酯等均是其挥发性香味的主要构成成分[19]，间接说明儿茶素的添加可能促进食醋中香味的产生；儿茶素的添加，减少了糠醇向糠醛的转化，而醛类物质是产生AGEs的前体物质，间接说明食醋中AGEs的含量减少，提高了食醋的质量安全品质。

3 讨论

食醋的生产原料中含有大量能够促进美拉德反应的反应物，也满足美拉德反应的条件，因此食醋在生产过程中发生美拉德反应是可能的，这也是影响食醋营养物质和色泽的一个重要因素。通过测定真实醋液与模拟醋液中食醋中AGEs的含量及抑制率，说明食醋中存在的大量还原糖和蛋白质使得食醋在储藏过程中发生了美拉德反应，而模拟醋液的抑制效果更好，则表明真实食醋中还存在着其他能够促进美拉德反应的因子。

儿茶素作为一种天然的抗氧化剂，添加不同浓度到模拟醋液与真实醋液中，得出：随着儿茶素浓度的增加，食醋液中的总酚含量也增加，且与浓度呈正相关；食醋液中的色率会降低，说明儿茶素能够抑制食醋在储藏过程中美拉德反应的发生；通过对比模拟醋液与真实醋液中儿茶素对AGEs的抑制效果，得出儿茶素能够抑制食醋中AGEs的产生，且抑制效果与儿茶素浓度呈正相关性；儿茶素的添加，使得食醋中的部分酸类和酯类的含量增加，而酸类与酯类正是食醋中风味与呈味物质的重要组成物质，间接表明儿茶素的添加能够促进食醋风味物质与呈味物质的产生，同时也减少糠醇向糠醛的转化，而醛类物质是产生AGEs的前体物质，间接说明儿茶素的添加能够减少AGEs的产生，保证食醋储藏过程中的安全和品质。