超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉和液体奶中的壬基酚

◎ 方 玲

（上海天祥质量技术服务有限公司，上海 200233）

壬基酚（NP）是一种公认的环境激素，具有雌激素类特性和生物毒性，其对生物体的不良作用包括对内分泌系统、生殖系统和免疫系统的影响以及致癌作用等[1-2]。而调查发现，壬基酚大量存在于婴幼儿配方奶粉中，对于主要食用配方奶粉的婴幼儿来说有着极高的安全风险，壬基酚在刚开始发育的婴幼儿身上作用将更加明显，可能对婴幼儿的内分泌系统造成不可逆转的影响，使得婴幼儿性发育速度过快，免疫能力差[3]。近年来，国家对婴儿配方食品安全监管日趋严格，除了定期对日常营养指标有抽检外，一些婴儿配方食品中可能存在的有毒及环境污染物质也列入风险监测，其中就包括近年人们越来越视和关注的壬基酚[4]。

目前，测定壬基酚残留的文献比较多，方法主要是气相-气质联用法[5]和液相-质谱联用法[6-8]等。本研究建立了另外一种超高效液相色谱-串联质谱（UPLCMS/MS）测定奶粉和液态奶中壬基酚的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验用水，超纯水；甲醇（色谱纯）和乙腈（色谱纯），德国默克公司；乙酸乙酯（色谱纯）、环己烷（色谱纯），美国Fisher 公司；壬基酚标准品及同位素内标（纯度＞99%），Dr. Ehrenstorfer GmbH，上海安谱公司代购。

1.2 主要仪器与设备

超高效液相色谱-串联质谱仪，美国Waters 公司TQS；分析天平，梅特勒-托利多；移液枪，Thermo；超声仪，上海科导超声仪器有限公司；冻干机，北京博医康实验仪器有限公司；超低温冰箱（-80 ℃），Thermo；旋转蒸发仪，BUCHI Labortechnik AG。

1.3 标准溶液的配制

1.3.1 壬基酚标准中间液

准确移取1 000 µg/mL的壬基酚标准品100 µL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度。该标准中间液的浓度为10 µg/mL，再移取100 µL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度。该标准中间液的浓度为100 ng/mL。置于1～4 ℃冰箱保存，可保存6个月。

1.3.2 壬基酚内标标准中间液

准确称取1 mg的壬基酚标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释定容至刻度。该标准储备液的浓度为100 µg/mL。再准确移取100 µL的上述储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释定容至刻度。该标准中间液的浓度为1 µg/mL。再准确移取1 mL该储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释定容至刻度，该标准中间液的浓度为100 ng/mL。置于1～4 ℃冰箱保存，可保存6个月。用移液枪准确吸取上述标准贮备液适量，用乙腈稀释，配制成一系列标准工作溶液，质量浓度范围为0.5、1、2、5、10 ng/mL。

1.4 样品处理

称取奶粉样品2 g到25 mL玻璃比色管中，用移液枪准确加入壬基酚内标标准中间液（100 ng/mL）100 uL，再用移液枪准确移取10 mL环己烷∶乙酸乙酯=1∶1于玻璃比色管中，涡旋混匀1 min后超声20 min，静置2 h，取上清液5 mL待GPC净化。

GPC流动相为环己烷∶乙酸乙酯=1∶1，流速为5 mL/min，收集8～20 min流出的溶液于100 mL鸡心瓶中，在40 ℃下，80 r/min旋蒸至近干，用1 mL乙腈复溶后，上机检测分析。

牛奶试样用-80 ℃冰箱预冻3～4 h后，放置于冻干机中，冷冻干燥至干，再按照上述奶粉样品前处理方法进行处理。

所有用到的玻璃器皿均用环己烷∶乙酸乙酯=1∶1清洗两遍，且须在临使用前准备。

由于环境中普遍存在壬基酚，因此GPC净化后的溶液须尽快旋蒸处理，避免放置时间过长。整个实验用的试剂均须现配现用，处理后的试样须尽快上机分析。

1.5 仪器分析条件

1.5.1 液相色谱条件

色谱柱，Waters Xbridge BEH C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；流动相，A相为水，B相为甲醇；流速，0.3 mL/min；进样量，5 μL；柱温，40 ℃。梯度洗脱条件，见表1。

表1 流动相及梯度洗脱条件表

1.5.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；负离子扫描模式；多反应监测（MRM）模式；源温度350 ℃；毛细管电压3.0 kV；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流量800 L/h，具体的离子采集参数，见表2。

表2 壬基酚质谱采集参数表

2 方法验证

2.1 方法线性范围与检出限

在上述试验条件下，配制NP的质量浓度0.5～10 μg/kg的系列标准工作液，内标浓度为5 μg/kg，将NP的定量离子的峰面积与内标的定量离子峰面积比对，绘制标准曲线，线性关系和相关系数见表3。以加标样品中NP色谱峰的信噪比S/N=3对应的浓度为方法的检出限（LOD），其检出限为 1μg/kg，以加标样品中NP色谱峰的信噪比S/N=10对应的浓度为方法的定量限，其定量限为 3μg/kg，灵敏度能够满足食品检测的要求。

表3 NP的线性范围、相关系数及检出限、定量限表

2.2 方法回收率及精密度

在奶粉中添加20 µL浓度为100 ng/mL的壬基酚标准中间液，做10平行，按上述试验条件进行处理和测定，内标法计算NP的回收率和相对标准偏差（RSD）。由表4可知，加标回收率为80%～95%，相对标准偏差＜10%，由此可见此方法回收率和精密度良好。样品加标的离子色谱图如图1所示。

表4 奶粉中NP的加标回收率与相对标准偏差表

图1 样品加标的离子色谱图

3 结论

本文该法建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定奶粉和液态奶中壬基酚的分析方法，检出限为1 μg/kg，可以满足配方奶粉及液态原料乳中壬基酚残留量的需求，可以作为企业判断是否有壬基酚污染的手段之一。由于壬基酚对婴幼儿的发育有很严重的危害，由此相关部门对污染源展开了调查，结果显示，婴幼儿配方乳粉当中主要的壬基酚成分来自于奶粉的外包装、加工过程以及原料，需加强对原料、包装材料以及生成过程中的接触材料中壬基酚含量的检测及控制，不使用含有壬基酚成分的容器中和管道，通过更换不锈钢材质的管道、容器及采用马口铁包装从源头上控制污染[3，9]。