黄芪多糖对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用研究
2018-09-12石军飞金殿生
石军飞 刘 娟 闫 超 金殿生
(1 内蒙古医科大学第二附属医院 药剂科,内蒙古 呼和浩特 010030;2 内蒙古自治区第四医院 呼吸内科,内蒙古 呼和浩特 010000;3 呼和浩特市第一医院 超声科,内蒙古 呼和浩特 010000)
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是指存在于血管壁且组成其主要部分的特定类型细胞,维持血管张力的主要细胞成分,其结构及功能的改变是导致高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等多种心血管病的细胞病理学基础。许多研究表明,VSMCs的异常增殖和凋亡是导致心脑血管疾病的主要因素[1]。黄芪多糖是豆科植物黄芪(Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.)的干燥根经提取而成的水溶性多糖,黄芪多糖是黄芪发挥作用的主要成分。黄芪作为常用中草药,具有益气固表、敛汗固脱、托疮生肌、利水消肿之功效。其主要含有皂苷类、多糖类、黄酮类、氨基酸及各种微量元素等成分。但其主要成分为黄芪多糖,含量高达50%以上,极具药用价值。黄芪多糖可作为免疫促进剂或调节剂,同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化应激等作用[2-3]。本文拟通过建立大鼠实验模型,探讨黄芪多糖在VSMCs增殖过程中的抑制作用及机制。
1 材料与方法
1.1 材料:雄性SD大鼠,体质量200~220 g,购自中国医学科学院医学实验动物研究所,合格证号SCXK(京)2016-0008,恒温(22~25 ℃)、恒湿(55±5)%饲养,所用食物和水均灭菌处理。黄芪多糖购自中国食品药品检定研究院。
1.2 大鼠VSMCs的培养与分组:采用5%水合氯醛麻醉大鼠,在无菌操作台上迅速分离取出大鼠胸主动脉,置于4 ℃的无菌DMEM溶液中。PBS液反复冲洗血管,用消毒棉签插入血管腔内来回抽插去除内皮细胞,再用眼科镊剥除血管外膜。剪开血管,再用PBS液冲洗3次,用手术剪将血管剪成1 mm2左右的组织块,将组织块移入培养瓶,向含DMEM培养基的培养瓶内加入10%胎牛血清,37 ℃,5%CO2的培养箱中孵育72 h,每24 h换液1次。观察细胞生长状态,待细胞融合达80%以上时,弃去旧培养液,用PBS液冲洗细胞3次,继续进行传代培养。本实验采用第5~7代VSMCs细胞。将培养至第5~7代的VSMCs分为四组:对照组和黄芪多糖30、60、90 mg/L剂量组。
1.3 3H-TdR掺入率实验:将VSMCs接种于96孔培养板上(1×106/L),培养48 h后换新鲜培养液,待细胞生长至90%融合时,弃去培养液,换用DMEM培养液,继续饥饿培养24 h。对照组每孔加入10% FBS,黄芪多糖组每组分别加入黄芪多糖溶液30、60、90 mg/L,同时加入10% FBS。48 h后,对照组和黄芪多糖组均加入3H-TdR(3.0×105Bq/L),继续孵育48 h。采用β-液体闪烁仪测定VSMCs的CPM(count per minute)值。
1.4 MTT法检测VSMCs增殖:取第5~7代VSMCs加入0.5%胰蛋白酶消化,用含10%胎牛血清的DMEM培养基配成细胞悬液,接种于96孔培养板上(1×106/L),培养48 h后换新鲜培养液,待细胞生长至80%融合时,弃去培养液,换用DMEM培养液,继续培养24 h。对照组每孔加入10% FBS,黄芪多糖干预组分别加入黄芪多糖溶液30、60、90 mg/L,同时加入10% FBS。每组设5个复孔、2个不加细胞的空白对照孔。将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱孵育分别培养12、24、48 h。每孔加入MTT液30 μL,继续置于37 ℃、5% CO2培养箱孵育8 h,弃去上清液,加入100 μL DMSO,震荡5 min。采用酶标仪于490 nm波长处测定各孔吸光度值。
1.5 统计学处理:采用SPSS 13.0数理统计分析软件处理实验数据,数据以(±s)表示,用t检验比较组间差异的显著性,以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 黄芪多糖对VSMCs DNA合成的影响:3H-TdR掺入率实验结果显示,对照组VSMCs的3H-TdR掺入量最高,而黄芪多糖干预组与对照组相比较3H-TdR掺入量明显下降(P<0.01),具有统计学意义。且随着黄芪多糖给药浓度增加,3H-TdR掺入量呈下降趋势。表明黄芪多糖可抑制VSMCs DNA合成,进而抑制VSMCs的过度增殖,见表1。
表1 黄芪多糖对VSMCs DNA合成的影响(±s)
表1 黄芪多糖对VSMCs DNA合成的影响(±s)
注:与对照组相比较,*P<0.01
组别 3H-TdR CPM值对照组 9518.36±491.58黄芪多糖30 mg/L 7565.30±430.26*黄芪多糖60 mg/L 4913.29±391.54*黄芪多糖90 mg/L 3536.85±428.27*
2.2 VSMCs增殖测定结果:与对照组相同时间吸光度值相比较,黄芪多糖干预组(30、60、90mg/L)吸光度均显著下降,且黄芪多糖低剂量组48 h与对照组比较具有显著性差异(P<0.05),黄芪多糖中、高剂量组12 h、24 h、48 h与对照组比较军具有显著性差异(P<0.05),具有统计学意义。且随着黄芪多糖浓度的增加,同一时间测得的吸光度值降低呈下降趋势。说明黄芪多糖对大鼠VSMCs具有抑制作用,且随着黄芪多糖剂量的增加,抑制作用也逐步增强,见表2。
表2 VSMCs吸光度值测定结果(±s)
表2 VSMCs吸光度值测定结果(±s)
组别 吸光度值(OD值)12 h 24 h 48 h对照组 0.416±0.003 0.581±0.007 0.925±0.005黄芪多糖30 mg/L 0.367±0.005 0.512±0.004 0.638±0.006黄芪多糖60 mg/L 0.304±0.002 0.425±0.008 0.522±0.005黄芪多糖90 mg/L 0.261±0.004 0.336±0.002 0.415±0.003
3 讨 论
血管壁由内皮细胞和平滑肌细胞构成,血管内皮细胞和平滑肌细胞的相互作用是促进血管形成的主要因素,也影响着血管正常生理功能的发挥。VSMCs根据其功能和形态分为收缩型和合成型,在生理状态下,VSMCs主要以收缩型来维持正常的血管张力,病理状态下,VSMCs主要以分泌型为主导,并具有更强大的增殖和迁移活性[4]。当血管中膜的VSMCs由收缩型转变为合成型时,开始迁移至血管内膜并大量增殖,此为血管损伤后的一种自身修复响应,也是血管再狭窄形成的主要病理过程之一[5-6]。因此,通过抑制VSMCs的异常增殖和迁移是预防血管再狭窄的主要途径。
黄芪多糖是从黄芪中采用传统的水提醇沉工艺提取而来,是黄芪中的主要活性成分。研究表明,黄芪多糖具有多种药理作用。Han等研究证实,黄芪多糖可提高实验大鼠机体的抗氧化能力,减轻由高脂饮食导致的氧化损伤[7]。另有报道,黄芪多糖能通过改变细胞内信号分子,进而影响淋巴细胞信号传导,达到调节免疫功能的作用。黄芪多糖还可显著提高血清超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性[8]。黄芪多糖作用于细胞膜的TLR4、CR3等受体,引起炎性因子释放,诱导Th1、Th2发生免疫反应,进而可提高巨噬细胞吞噬功能,诱导一氧化氮的体内合成[9]。
VSMCs在正常生理条件下,主要起到调节血管壁张力,分泌释放各种血管调节因子和维持血管正常生理功能的作用。但当血管内皮环境受到损伤后,会释放一些炎性细胞因子,这类细胞因子可激活细胞内信号传导通路,促进VSMCs增殖[10]。而VSMCs的异常增殖和迁移是导致各种心血管疾病的病理基础。本实验研究表明,黄芪多糖可有效抑制FBS诱导的VSMCs过度增殖,且随浓度增加,抑制作用也逐渐增强,从而可起到抑制血管腔狭窄的作用。
本研究证实黄芪多糖具有抑制VSMCs过度增殖的作用,可有效预防血管腔狭窄发生。鉴于血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化性病变的关键机制和干预靶点,因此,我们将会进一步通过建立实验模型阐明其作用机制。黄芪多糖也有望为动脉粥样硬化性疾病的防治提供新的防治途径。