HPLC法测定益宫颗粒中阿魏酸的含量

高松红 单柏宇 徐 阳 孙 莹*

（1 长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031；2 白城市食品药品检验所，吉林 白城 137000）

益宫颗粒是由黄芪、当归、续断、益母草、丹参、党参、香附、败酱草八味中药组成，具有温经止痛和活血化瘀的功效，对于生产后的虚弱受寒所致的小腹疼痛和恶露不绝等症具有良好疗效[1-3]。处方中的黄芪与当归配伍，可以补益气血、培补元气、调和营卫，养气以生血、治从补气以行血，平衡机体内的阴阳。续断则具有强经补肾之功效，可促进津液和血液归于肾经，摄而防止外漏[1-3]。党参能够调节脾胃、健运脾气、补血益气。益母草与丹参配合使用具有祛瘀生新的药效。败酱草具有排出淤血和去除浊气的作用。香附具有行气化血和舒肝养肝的作用。

通过大量的临床研究表明，益宫颗粒可作为治疗产后出血多，恶露时间长的首选药，但是针对此药的质量标准研究却不健全[4-8]。阿魏酸是君药当归的主要活性成分，也是《中国药典》中含量测定的指标性成分。通过研究发现阿魏酸及衍生物具有多方面药理作用和生物活性，能清除自由基，促进清除自由基的酶的产生，增加谷胱甘肽转硫酶和醌还原酶的活性，并抑制酪氨酸酶活性，来调节人体生理功能[11-14]。阿魏酸可以抗血小板聚集，抑制血小板5-羟色胺释放和血小板血栓素A2（TXA2）的生成，同时可增加前列腺素活性，可镇痛，并可以缓解血管痉挛等[15]。是治疗白细胞减少和心脑血管疾病等症药品的基本原料，且毒性较低，在医药、保健品、化妆品原料和食品添加剂等方面有着广泛的用途。建立HPLC法测定其在益宫颗粒中的含量，为进一步质量标准的建立奠定基础。见图1。

1 材 料

图1 阿魏酸结构

SHIMADZU LC-2030型高效液相色谱仪（日本岛津仪器设备有限公司）；RE 52-99旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；AUW-120D型电子天平（日本岛津仪器设备有限公司）；KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

阿魏酸（中国药品食品检定研究院，批号：110773-200611）；乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；水（纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司）；磷酸、无水乙醇（均为分析纯，北京化工厂）。

益宫颗粒（陕西健民制药有限公司，批号见表2）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：Diamonsil C18 （4.6 nm×250 nm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）；体积流速：1.0 mL/min；检测波长为360 nm；柱温：35 ℃；进样量均为10 μL。理论塔板数按阿魏酸计算不低于3000，在此条件下，阿魏酸与其他物质分离度均＞1.5，符合药典规定，空白色谱图无干扰，供试品中阿魏酸色谱峰通过HPLC-DAD检测器测定，色谱峰纯度＞990，专属性良好。结果见图2、3、4。

2.2 对照品溶液的配制：精密称约5 mg阿魏酸对照品，置于100 mL容量瓶中，适量甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密吸取0.2～10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，制备成1 mL约含阿魏酸0.01 mg的对照品溶液。

图2 空白色谱图

图3 阿魏酸对照品色谱图

图4 益宫颗粒供试品色谱图

2.3 供试品溶液的配制：取益宫颗粒，粉碎，精密称定5 g，加20 mL的无水乙醇超声提取30 min，过滤，收集滤液，重复提取3次，合并滤液，于60 ℃旋转蒸干，用甲醇溶解并转移置10 mL量瓶中，定容至刻度，即得。

2.4 线性关系考察：精密称取25.75 mg阿魏酸对照品，置于100 mL量瓶中，适量甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，分别吸取2、1、0.5、0.25、0.2、0.1 mL，置于10 mL量瓶中，适量甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。即浓度为0.05150 mg/mL、0.02575 mg/mL、0.012875 mg/mL、0.0064375 mg/mL、0.00515 mg/mL、0.00258 mg/mL的线性关系对照品溶液。按照“2.1”项下方法，将各浓度线性关系对照品分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱峰的峰面积。以色谱峰面积为Y轴，溶液浓度为X轴作图，得到阿魏酸的回归方程为Y=26352X+10.3823，r=0.9998（n=6），表明阿魏酸在0.00258～0.05150 mg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验：按照“2.1”项下方法，分别精密吸取对照品溶液和益宫颗粒供试品溶液（批号：201606308）各10μL，分别连续6次注入高效液相色谱仪中，记录色谱峰的峰面积，结果阿魏酸对照品和益宫颗粒供试品色谱峰面积的RSD值分别为0.98%和1.62%，结果表明此方法具有良好的精密度。

2.6 稳定性考察：分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h时，按照“2.1”项下方法分别精密吸取对照品溶液和益宫颗粒供试品溶液（批号为：201606308）10 μL，依次进入高效液相色谱仪中，记录色谱峰面积，结果阿魏酸对照品和益宫颗粒供试品色谱峰面积的RSD值分别为0.47%和1.68%（n=8），结果表明供试品溶液中阿魏酸在24 h内具有良好的稳定性。

2.7 重复性实验：精密称取益宫颗粒（批号：201606308）6份，每份约10 g，按“2.3”项下制备供试品溶液，测定阿魏酸色谱峰面积，并进行含量测定，结果其含量的RSD值为1.84%，结果表明此方法具有良好的重复性。

2.8 加样回收率实验：精密称取阿魏酸对照品6份，每份约15 mg，至100 mL容量瓶中，适量甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，精密吸取0.5 mL，分别加入6份约2.5 g的益宫颗粒（批号：201606308）中，按照“2.3”项下供试品溶液制备方法进行制备，并对其含量进行测定，计算阿魏酸回收率。结果其平均回收率为100.47%，RSD值为0.70%（n=6），表明此方法具有良好的回收率。结果见表1。

表1 加样回收率测定结果

2.9 样品测定：选取3批益宫颗粒，按照“2.3”和“2.2”项下方法对供试品溶液和对照品溶液进行制备，分别注入液相色谱仪10 μL，按照外标法对不同批次的供试品中阿魏酸的含量进行计算，结果见表2。

表2 益宫颗粒中阿魏酸的含量测定结果

3 讨 论

通过对比热回流提取法、超声提取法、索氏提取法和浸渍法等提取方法配合石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和无水乙醇等试剂进行提取[16-18]，最终确定以无水乙醇为提取溶剂，采用超声提取法进行提取，此提取方法可以快速、准确的将阿魏酸从益宫颗粒中提取出来。

在色谱条件筛选上，本实验选取360 nm波长进行测定，在此波长下阿魏酸具有良好的吸收，且在益宫颗粒供试品中，具有良好的分离度，符合药典规定。本实验通过对比乙腈-水（或磷酸水）、甲醇-水（或磷酸水）、乙腈-甲醇-水（或磷酸水），最终确定乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）为最佳的色谱条件，阿魏酸在酸性流动相中具有更好的峰型和分离效果。本实验对不同色谱柱温度进行考察，发现较高的温度对阿魏酸的分离效果具有较好的作用，但较高的色谱柱温度会影响色谱柱的使用时间，最终确定35 ℃为最佳的色谱柱温度。

益宫颗粒具有良好的药效作用，且被广泛应用，但并无一种HPLC相关的质量控制方法。阿魏酸具有良好的药效作用，在多方面具有良好的药效作用，是益宫颗粒中君药当归中的主要药效成分，往往以阿魏酸的含量来评价当归的质量，故本实验建立一种测定益宫颗粒中阿魏酸含量的方法，从而评价益宫颗粒的质量，为其质量控制奠定研究基础。