低磷胁迫条件下大豆磷高效近等基因系主要农艺性状分析

刘 萍，董文汉，王明君，尹元萍，董蓉娇，张 慧，梁 泉 *

(1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学科技处，云南 昆明 650201；3.云南农业大学资源与环境学院，云南 昆明 650201)

【研究意义】大豆是重要的粮、油、饲兼用作物，也是人们日常生活中优质蛋白和食用油的主要来源。大豆是喜磷作物，磷不仅是大豆遗传物质的重要组成成分，同时参与了大豆的光合作用、呼吸作用、能量转化、信号转导、生物大分子合成以及酶活性的调节等，在大豆整个新陈代谢过程中扮演着十分重要的角色[1]。虽然土壤中的磷含量很高，但大多数磷都不能被植物直接吸收利用，其有效性较低，难以满足大豆生长的需要[2]。中国土壤中效态磷含量不足30 mg/kg，而大豆可利用的磷往往不足土壤磷的50 %[1-2]。华南地区的酸性红壤上，磷素对大豆产量的影响尤甚[4-5]。【前人研究进展】大豆磷效率遗传改良是解决土壤磷供应不足的经济而有效途径[2]。传统的育种方法由于手段单一，在改良诸如磷效率等数量性状上有很大的局限性[2-4]。对大豆磷效率进行遗传改良，需要了解大豆高效吸收利用磷的生理和分子机制，从外源种质资源中发掘和利用新的优良基因资源[1]。构建近等基因系是解析植物对低磷胁迫的响应机制的有效途径。近等基因系(Near Isogenic Lines，NILs)是指一组遗传背景相同或相近，而某个特定性状或其遗传基础有差异的一组品系。最早应用NILs的报道是关于大豆根瘤方面的研究[5]。近年来，应用NILs在作物遗传育种[6-7]、QTL精细定位和基因功能研究[8-9]等方面发挥了重要作用。【本研究切入点】本试验以2个在根形态性状和磷效率等方面具有显著差异的大豆品种BD2和BX10为亲本材料，采用回交和自交法，经表型结合与根形态构型相关磷高效密切连锁的SSR标记辅助选择技术，在BC5F3获得含5个单株的磷高产QTLs高代材料，它与轮回亲本BX2构成了大豆根形态构型相关磷高效近等基因系。【拟解决的关键问题】在低磷胁迫条件下考察该NILs株高、生育期、叶面积、叶柄夹角、产量及其构成因素等特性的表达差异，旨在了解根形态构型相关磷高效QTLs的导入和表达对大豆生物学性状的影响，为未来生理生化和基因克隆研究提供材料基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究采用2个在根系性状和磷效率方面差异较大的大豆品种作为亲本材料，分别是巴西引进品种“巴西10号”(BX10)，广东博罗县地方品种“本地2号”(BD2)。

BD2来源于广东省博罗县，是当地普遍栽培的农家品种。BX10来源于巴西，是一个高度栽培化的长青春期大豆品种，浅根型，粒大，生物量较高，丰产性较好。而BD2则具有较多的原始性状，植株半蔓生，深根型，粒小，生物量和产量较低。以根形态构型和磷吸收效率等为指标，BD2为深根、磷低效敏感型，而BX10为浅根、高效不敏感型[3,10]。

1.2 构建方法

以磷低效和深根型的BD2为轮回亲本，以磷高效和浅根型的BX10为供体亲本，采用连续回交、自交法和异地穿梭加代，春季在昆明种植回交后代，每个后代单株选取15～20朵花去雄，并授以BD2花粉，秋季在云南元江县(东经102°00′，北纬23°59′，海拔880 m)种植回交后代，并在苗期提取叶片DNA，以根系形态构型相关磷高效的特异性SSR标记[11]进行辅助选择，收获时挖掘根系观察，收获后抽样进行室内水培验证，表型、特异性SSR标记和室内水培验证相结合，1年完成1个世代，包括回交和后代检测。这样反复进行，回交5次，然后选单株自交、鉴定，于2015年秋季得到包含A2、A4、A5、A6、A8共计5个磷高效相关根形态构型近等基因系株系，5个株系共有326粒种子，并加代繁殖形成326个家系。

1.3 田间试验和性状调查

试验在石林县板桥镇进行。土壤pH值5.54，有机质34.6 g/kg，全氮1.467 g/kg，全磷1.62 g/kg，全钾8.96 g/kg，碱解氮105.4 mg/kg，速效磷5.08 mg/kg，速效钾113.7 mg/kg。设高磷(160 kg/hm2)和低磷(不施磷)2水平，氮、钾肥料用量(纯量)，分别为：N75 kg/hm2，K2O 60 kg/hm2。N、P、K分别由尿素、普钙和氯化钾提供。P、K统一作底肥一次性施用，尿素分2次追施。

从上述近等基因系A2、A4、A5、A6、A8等5个株系BC5F3群体中，每个家系取40粒种子共计种植200株，对照BD2种植200株，供体亲本BX10种植200株，每个小区每个家系(含BD2、BX10)分别种植10粒种子，4重复，其中：高磷处理为1个重复，低磷处理3次重复。

按照国家大豆区试调查记载标准调查株高、生育期、产量及其构成因素。

在初花期，每株系取样3株进行调查测定。

叶柄夹角(Leaf stalk angle, LAN)：倒三叶叶柄与茎垂直线的夹角，单位用“°”表示，每小区每个家系取2株共计10株测量，取平均值。

叶面积(leaf area, LAR)：应用 CI-203手持式激光叶面积仪测量大豆叶片面积，记录各个叶片的面积值(cm2)，在低磷处理每小区每家系取样1株共计5株，取平均值。

表1 低磷条件下亲本和NILs群体中的叶面积及叶柄夹角

图1 低磷条件下磷高效根形态构型近等基因系群体中叶面积的频率分布Fig.1 Frequency distribution of LAR in the NILs for root traits morphology and architecture related to high phosphorus-efficient at low phosphorus conditions

生物量和根冠比：初花期，低磷处理每小区每家系取样1株共计5株，高磷处理每个家系取样3株，田间挖掘完整植株、清洗干净，分根、地上部(茎、叶)杀青、烘干和称重，取平均值。

2 结果与分析

2.1 叶面积和叶柄夹角

在低磷条件下对双亲及NILs群体中叶面积和叶柄夹角进行统计分析(表1、图1～2)。

从表1和图 1～2中发现双亲在叶面积和叶柄夹角上存在较大差异，供体亲本叶面积较受体亲本大12.3 %，叶柄夹角则是受体亲本的1.87倍；150个NILs单株中，群体叶面积平均值31.762 cm2，与轮回亲本BD2接近，变异系数为21.2 %，总体上偏向于BD2；150个NILs单株中，群体叶柄夹角平均值58.036°，与轮回亲本BD2接近，变异系数为14.6 %，总体上偏向于BD2；叶面积和叶柄夹角均呈连续分布，说明这2个性状属多基因控制的数量性状，同时存在超亲(轮回亲本)分离的现象，但总体上偏向于轮回亲本(图1～2)。

2.2 生物量

双亲和NILs群体植株生物量和根冠比的比较见图3。供体亲本BX10的植株生物量总是高于BD2，其中低磷条件下高18.9 %、高磷条件下高36.6 %，说明BD2对介质磷浓度不敏感，属低效、迟钝型(徐青萍等，2003)(10)；2种磷水平下，NILs平均植株干重均处于双亲之间，其中：低磷条件下其生物量与BX10差异不显著，但与BD2差异显著；高磷条件下其生物量与BX10差异显著，与BD2差异达显著水平(图3-A)；2种磷水平下，NILs根冠比处于双亲之间，其中：低磷条件下其根冠比与BX10差异不显著，但与BD2差异显著；高磷条件下BX10、BD2、NILs三者之间根冠比的差异均未达到显著水平(图3-B)。说明经过多次回交后，NILs群体虽然基本恢复至轮回亲本BD2水平，但由于导入了供体亲本BX10高效磷相关根形态构型的基因，在植株生长势、根系性状等方面要优于轮回亲本BD2。

2.3 主要农艺性状

低磷和高磷2种处理条件下，NILs和轮回亲本BD2株高、生育期、产量及其构成因素(分枝数、总荚数、粒数、百粒重等)的比较见表2。NILs和轮回亲本BD2在株高、生育期性状上无差异：低磷条件下NILs平均株高55.91 cm、BD2则为54.62 cm，高磷条件下NILs平均株高分别为56.54和54.87 cm，NILs群体的5个株系间在高、低磷条件下均无显著差异；低磷条件下NILs生育期平均为103.2 d、BD2则为102 d，高磷条件下则分别为103.6和103 d，NILs群体的5个株系间在高、低磷条件下均无显著差异。

图2 低磷条件磷高效根形态构型近等基因系群体中叶柄夹角的频率分布Fig.2 Frequency distribution of LAN in the NILs for root traits morphology and architecture related to high phosphorus-efficient at low phosphorus conditions

同一处理的差异性采用t 检验，同列数字后不同小写字母表示不同品系间差异显著(P<0.05)The difference comparison used the t test in the same treatment, data with different small letters in the same column indicated significant difference at 0.05 level图3 双亲和磷高效根形态构型近等基因系群体植株生物量和根冠比Fig.3 The plant dry weigh and root-shot ratio of the parents and the NILs population for root traits morphology and architecture related to high phosphorus-efficient

NILs与轮回亲本BD2之间在分枝数和百粒重上均无显著差异：在低磷条件下，NILs群体5个株系分枝数和百粒重平均值分别为3.32个和15.38 g，变幅分别为3.40～3.68个、14.88～15.79 g，变异系数分别为3.04 %和2.38 %，而BD2则分别为3.05个和15.24 d；在高磷条件下，NILs群体5个株系分枝数和百粒重平均值分别为3.42个和15.86 g，变幅分别为3.66～4.24个、15.41～16.32 g，变异系数分别为5.68 %和2.67 %，而BD2则分别为3.16个和15.56 d。说明经多代回交和选择后，NILs基本回归至轮回亲本水平，同时也表明大豆分枝和百粒重主要由遗传因素决定，磷营养对其影响较小。

NILs与轮回亲本BD2之间在单株产量、总荚数、总粒数上均呈显著或极显著差异。在低磷条件下，NILs群体5个株系单株产量平均值为9.35 g，变幅为8.78 ～10.36 g，变异系数为8.0 %， BD2单株产量为7.64 g，NILs较BD2增17.76 %，A6、A8株系与BD2之间差异显著，A2、A4、A5与BD2间差异达极显著水平；5个株系单株荚数平均值为39.82个，变幅为37.2～42.4个，变异系数为8.72 %， BD2单株荚数为35.12个，NILs较BD2增13.38 %，A6、A8株系与BD2之间差异显著，A2、A4、A5与BD2间差异达极显著水平；5个株系单株粒数平均值为61.84粒，变幅为59.2～65.9粒，变异系数为10.76 %， BD2单株粒数为52.46粒，NILs较BD2增17.88 %，A6、A8株系与BD2之间差异显著，A2、A4、A5与BD2间差异达极显著水平。

表2 2种磷水平下近等基因系及轮回亲本主要农艺性状

注：*和**分别表示在0.05 %和0.01 %水平上差异显著。

Note:*and **indicated significant difference atP≤5 % andP≤1 % level respectively.

在高磷条件下，NILs群体5个株系单株产量平均值为12.36 g，变幅为11.22～13.26 g，变异系数为6.1 %， BD2单株产量为10.23 g，NILs较BD2增20.82 %；5个株系总荚数平均值为49.88个，变幅为44.5～55.3个，变异系数为8.81 %， BD2单株荚数为43.24个，NILs较BD2增15.36 %；5个株系单株粒数平均值为77.42粒，变幅为73.8～83.4粒，变异系数为7.04 %，BD2单株粒数为64.56粒，NILs较BD2增19.92 %。说明由于供体亲本BX10优良基因的导入，显著改善了NILs的产量及其相关性状。

无论低磷还是高磷条件下，NILs群体中5个株系之间在株高、分枝数、单株产量、单株荚数、单株粒数、百粒重等性状差异均未达显著水平；5个株系之间在株高、生育期、分枝数、百粒重等性状上，高磷条件与低磷条件下基本接近；与低磷条件相比，高磷时NILs单株产量、单株荚数、单株粒数分别增32.19 %、25.26 %和25.19 %，而BD2则分别增28.84 %、23.12 %和23.07 %。说明磷营养显著影响大豆产量。

3 讨 论

利用近等基因系可以最大限度地降低遗传背景差异，从而提高对QTL的定位、检测能力以及分子标记辅助育种等[8,12]。Clark首次应用大豆近等基因系研究根瘤，其后近等基因系被广泛应用于作物遗传与育种、基因精细定位和基因功能等研究。近等基因系的构建方法主要有回交法[13-15]、突变体分离法[16]、分子标记辅助导入法[6,8,17-18]和高世代分离法等[9,19]。

回交法是最常用方法，供本亲本与受体亲本杂交，在其后的各分离世代中每代均选择包含目标基因/性状的植株与受体亲本回交，连续回交4～6代，最后自交1～2代，从中筛选获得具有目标基因/性状的植株，该植株除了保留供体亲本的目标性状外，其遗传背景与轮回亲本相近，这样轮回亲本与该选育材料互为近等基因系。从理论上说，要从近等基因系中消除来自亲本供体的染色体位点需要多次回交，在回交过程中，除了目标性状基因的转移外，尽可能快速、完整地恢复轮回亲本的基因组成是构建近等基因系的关键。一般而言，经过5～6次回交即可育出近等基因系[12]。但是，回交法工作量大、周期长、选择效率低。近年来，利用分子标记进行目标性状的前景选择和轮回亲本的背景选择，可以快速、准确构建目标性状基因(QTL)的近等基因系。

本研究在前期工作中，利用2个在磷效率相关根系性状显著差异的大豆品种为材料构建磷效率相关根系性状重组自交系[3,20]，应用SSR标记在B1、C1、D1a、D2和F连锁群上初步定位了7个位点的磷效率相关根系性状QTLs[3,21]，再在上述7个位点两侧合成100对SSR引物进一步筛选，并结合田间试验、水培试验进行验证，最终获得磷高效相关根形态构型性状特异性SSR标记21对[11]。本研究仍以上述2个亲本为材料，应用回交法和特异性SSR标记辅助选择，结合田间表型性状对回交分离后代进行有效选择和鉴定，最终获得5个株系326个家系的磷高效相关根形态构型性状基因(QTL)的近等基因系。经田间低磷条件下鉴定，与受体亲本比较，在叶面积、叶柄夹角、株高、生育期、分枝数、百粒重等性状上差异不显著，但在单株产量、单株荚数和单株粒数等性状上存在显著或极显著差异，而 NILs内部5个株系之间差异不显著，上述性状一致性较高，是较理想的近等基因系。

根是作物从土壤中吸收养分的唯一途径。长期生长在低磷胁迫环境条件下，高等植物会形成一些适于土壤磷吸收的适应机制，包括根形态特征的演变(如根毛形成)、诱导酸性磷酸酶以及特异根系分泌物的形成和分泌等。许多研究结果表明，作物根形态构型可以作为作物磷效率的一个重要指标和遗传改良的重要方向[22-27]。土壤磷素有效性低和利用率不高严重影响了大豆的产量与分布。以大豆磷高效相关根形态构型近等基因系为材料，进一步揭示根系形态构型对低磷胁迫的响应以及相关的生理特征和分子机制，将有助于指导大豆磷营养的遗传改良工作，在提高大豆产量和品质以及实现化肥、农药“两个零增长”的目标发挥实质性的作用。

4 结 论

采用回交和自交法，经表型并结合与根形态构型相关磷高效密切连锁的SSR标记辅助选择技术，得到的BC5F3代近等基因系其叶面积和叶柄夹角呈连续分布，并偏向于轮回亲本，在株高、生育期、叶面积、分枝数、百粒重等性状上已基本回归到轮回亲本水平，但在低磷条件下其根冠比、单株产量、单株荚数和单株粒数等与受体亲本差异显著，株系间差异不显著，一致性程度较高，是较理想的近等基因系。

致谢:感谢华南农业大学根系生物学研究中心和云南省烟草农业科学研究院在大豆根系性状扫描分析上提供的帮助。