利于嗜热脂肪芽孢杆菌平板计数的培养方法

万爱玉 刘璇 万欣

摘要：本文研究了嗜热脂肪芽孢杆菌平板计数方法，通过培养基类型、平板培养基的使用量，培养时的温湿度及时间的控制，使得嗜热脂肪芽孢杆菌能够在平板上形成可观察的单菌落，利于进行计数。

关键词：嗜热脂肪芽孢杆菌；培养基；平板计数

嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermo—philus）属嗜热性需氧芽孢杆菌，但兼有厌氧的特性。该菌株运动性强，培养温度高，在平板上生长扩散快，很难形成单菌落[1]。

购买来的生物指示剂，要对其芽孢量进行测定，以判断是否符合灭菌程序的验证要求。为此对利于嗜热脂肪芽孢杆菌平板计数的培养方法进行了研究，以方便进行生物指示剂的孢子量确认。

一、材料和方法

（一）菌种

嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC7953（压力蒸汽灭菌生物指示剂，D121值1.3-1.9），孢子量F0≥8（103/只）。

（二）培养基

1.营养琼脂培养基（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉3.0，氯化钠5.0，琼脂14.0，pH值7.2±0.2（25'E）。121℃高压灭菌15分钟备用。

2.胰酪大豆胨琼脂培养基（g/L）：胰酪胨15.0，大豆木瓜蛋白酶消化物5.0，氯化钠5.0，琼脂15.0，pH值7.3±0.2（25℃）。121℃高压灭菌15分钟备用。

3.溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂培养基（g/L）：蛋白胨10.0，葡萄糖5.0，溴甲酚紫0.012，pH值7.0-7.2（25℃）。115℃高压灭菌30分钟备用。

（三）方法

将孢子量为103/只的嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC7953（压力蒸汽灭菌生物指示剂）用0.9%氯化钠溶液十倍稀释法稀释[2]，取O.1ml适当稀释度的菌悬液涂布于营养琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂培养基平板上，置于不同条件下培养。

二、结果

（一）培养基类型

嗜热脂肪芽孢杆菌对培养基的要求较低，本实验室所使用计数培养基通常为营养琼脂培养基和胰酪大豆胨琼脂培养基，考虑到嗜热脂肪芽孢杆菌的特殊性，经查阅资料，将溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂培养基加入选择当中。

在其它培养条件相同的情况下针对营养琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂培养基三种培养基进行了研究，结果发现营养琼脂培养基及胰酪大豆胨琼脂培养基在培养温度较高时培养基凝固效果不理想，较难形成肉眼可识别的单菌落无法进行计数。嗜热脂肪芽孢杆菌在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂上生长良好，单菌落明显且呈米黄色，与培养基的紫色形成对比，有利于计数。

（二）平板培养基的量

通常制备平板培养基所需的培养基的量为15-20ml，但由于嗜热脂肪芽孢杆菌的培养温度较高，水分蒸发较快，如果培養基的量较少，平板培养基易干裂。培养基的量确定为25ml。

（三）培养湿度控制的选择

培养基在高温下培养，若培养湿度过大，菌落扩散很快，会分布整个平板，很难形成单菌落。但湿度太小，平板易于裂。

针对湿度过大处理方案为33℃预培养2天，蒸发平板表面水分后使用。针对防止培养湿度过小处理方案为培养时在培养箱中放置装有100ml纯化水，以调节培养箱内湿度，防止平板干裂。

（四）培养温度

嗜热脂肪芽孢杆菌最低生长温度为28℃，最高生长温度70～77℃，最适生长繁殖温度为56～65℃。55℃培养24小时后可形成单菌落，但菌落过小，65℃培养24小时后菌落成片生长，均不利于计数。而60℃培养24小时后形成的单菌落大小合适，利于肉眼计数且未成片生长。

（五）培养时间

60℃培养18小时后形成较小的单菌落，肉眼计数较困难。培养24小时后形成的单菌落大小合适，利于肉眼计数。培养32小时后菌落成片生长不利于计数。

三、讨论

嗜热脂肪芽孢杆菌由于培养时需要的温度较高，导致水分蒸发较快，因此要注意培养时的温湿度控制，并通过调整培养基的类型及平板的厚度使得其能在合适的培养时间得到肉眼可见且不扩散的单菌落，从而达到利于计数的目的。

参考文献：

[1]任香芸，陈济琛，蔡海松，林新坚，邱宏端.嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长特性与培养条件研究[J].生物技术，2007（02）.

[2]李华.平板菌落计数的改进方法[J].生物学通报，2006（01）.