山东省滕州市羊隐孢子虫感染检测与其actin序列分析

朱 维，米荣升，王进香，王 翠，黄 燕，张烨华，贾海燕，张晓丽，韩先干，陈兆国

（1.山东省滕州市畜牧兽医技术服务中心，滕州277599；2.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室（上海） 农业部动物寄生虫学重点实验室，上海200241；3.宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，银川 750011；4.河南省动物疾病预防控制中心，郑州450008）

隐孢子虫病（cryptosporidiosis）是重要的人兽共患寄生虫病，该病呈世界性分布，广泛存在于大洋洲、美洲、亚洲、非洲和欧洲等多个国家和地区[1]。2004年，世界卫生组织将隐孢子虫病列为被忽视疾病[2]。目前还未有有效的药物治疗该病。

羊各个年龄均能够感染隐孢子虫，但隐孢子虫主要对羔羊致病，轻者消瘦、阻碍生长，重者引发腹泻，甚至死亡，造成严重的经济损失。1974年，Baker和 Carbonell首次在澳大利亚绵羊中发现隐孢子虫感染[3]，随后世界范围内都有报道。研究表明，羊感染的虫种主要有3种，包括微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum，C. parvm）、肖氏隐孢子虫（C. xiaoi）和泛在隐孢子虫（C. ubiquitum）；其他隐孢子虫虫种，如人隐孢子虫（C. hominis）、安氏隐孢子虫（C.andersoni）、猪隐孢子虫（C. suis）、母猪隐孢子虫（C. scrofarum）、费氏隐孢子虫（C. fayeri）和隐孢子虫绵羊基因型也见报道，这些虫种多数是人兽共患的隐孢子虫[4]。

山东省是我国养殖大省，2015年羊的存栏量为2235.66万头，仅次于内蒙古自治区和新疆维吾尔自治区。目前，关于山东省羊隐孢子虫感染情况鲜有报道。2013年，李梦婕等[5]对山东东营地区绵羊样品的检测未发现隐孢子虫感染；2014年，Mi等[6]对山东滕州地区100份山羊样品进行了检测，感染率为18.00%，仅发现C. xiaoi感染，未对该地区绵羊隐孢子虫进行检测。据统计，山东滕州地区2015年羊的存栏量为40.9万头[7]，然而羊感染隐孢子虫的分子特性目前并不清楚。因此，为了初步弄清滕州市羊感染隐孢子虫的分子特性，本研究选取了该市2个绵羊养殖场和2个山羊养殖场，采集羊粪样品，提取DNA，以隐孢子虫肌动蛋白（actin）基因为靶基因进行巢式PCR扩增，鉴定绵羊和山羊感染的虫种或基因型，评估其对人群的潜在威胁，为该地区羊隐孢子虫病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 用于阳性对照的C. parvum 基因组DNA由中国农业科学院上海兽医研究所动物源性病原生物学与食品安全创新团队保存；FastDNA Spin Kit for Soil基因组DNA提取试剂盒购自MP公司；KOD DNA聚合酶购自TOYOBO公司；pZero Back/blunt载体购自天根生化科技（北京）有限公司；Trans1 T1感受态细胞、DNA Marker DL2000购自北京全式金生物技术有限公司，AxyPrep DNA胶回收试剂盒购自美国Axygen公司。

1.2 粪便样本的采集 2016年5～6月，分别从山东省滕州市2个山羊养殖场和2个绵羊养殖场采集新鲜粪便，共采集样品222份，其中绵羊102份，山羊120份。样品置于冰盒中保存，带回实验室，1 w内处理完。

1.3 样品的处理 取5 g待检样品放入烧杯中，加50 mL PBS，压舌板混匀后经4层纱布过滤，滤液移入50 mL离心管中，2500×g，离心10 min。沉淀加10 mL PBS吹打混匀，吸取2 mL放入离心管中，-20℃保存，用于DNA提取。其余滤液离心后加入2.5%重铬酸钾溶液，4℃保存备用。

1.4 样品DNA的提取 取-20℃保存的2 mL滤液，用PBS反复洗3次，提取基因组DNA。提取方法参照FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒说明书进行。

1.5 引物的设计和合成 参考Ng等[8]合成基因引物，其中第一轮PCR的上游引物（NAF1）：5'-ATG CCVGGWRTWATGGTDGGTATG-3'；下游引物（NAR1）：5'-GGDGCAACRACYTTRATCTT C-3'。第二轮PCR的上游引物（NAF2）：5'-GA YGARGCHCARTCVAARAGRGGTAT-3'；下游引物（NAR2）：5'-TTDATYTTCATDGTHGAHGG WGC-3'。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.6 样品PCR扩增 采用巢式PCR扩增隐孢子虫actin基因，其中第一轮为25 μL体系，第二轮为50 μL体系。具体如下：在第一轮反应体系中加入2×PCR buffer（含Mg2+）12.5 μL，10 μmol/L引物NAF1、NAR1 各 0.5 μL，2 mmol/L dNTP 4 μL，1 U/μL KOD酶0.5 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O补至25 μL；第二轮反应体系中加入2×PCR buffer（含Mg2+）25 μL，10 μmol/L引物NAF2、NAR2各 1 μL，2 mmol/L dNTP 8 μL，1 U/μL KOD酶1 μL，第一轮PCR产物模板1 μL，加ddH2O补至50 μL。两轮PCR反应条件相同：95℃预变性5 min；95℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。取5 μL扩增产物进行琼脂凝胶电泳鉴定。

1.7 目的基因克隆与序列鉴定 将扩增为阳性的样品进行胶回收，克隆至pZero Back/blunt载体，转入Trans1 T1感受态细胞中，进行37℃培养。挑取阳性菌落于LB培养基中培养，进行PCR鉴定。经鉴定为阳性的菌液送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。所获得序列通过Blast搜索比对，确定感染的虫种或基因型。

1.8 不同种间actin基因的进化树分析 从GenBank下载不同种隐孢子虫的actin基因，与本试验获得的序列进行系统进化树分析。用软件MEGA 7.0以邻接法（neighbor-joining，NJ）分析本试验获得的羊源隐孢子虫actin基因与GenBank中的其他种的隐孢子虫actin基因之间的亲缘关系。

1.9 数据统计和分析 利用Microsoft Excel 2013和SPSS 21.0软件对获得的数据进行整理和统计分析，采用卡方检验（χ2）方法，比较绵羊和山羊在不同养殖场、不同日龄之间的差异是否显著。当P≤0.05时，判定为差异显著；当P≤0.01时，判定为差异极显著。

2 结果

2.1 隐孢子虫actin基因的PCR扩增 以提取的绵羊和山羊样品DNA为模板，进行隐孢子虫actin基因巢式PCR扩增，结果阳性对照组和部分样品成功地扩增出了特异性片段，大小约为820 bp，与预期大小相符（图1）。

2.2 不同养殖场之间隐孢子虫感染的分子流行情况对滕州市2个绵羊养殖场和2个山羊养殖场采集的222份样品DNA进行PCR扩增，阳性样品进行序列测定。结果显示，该地区绵羊和山羊总感染率为6.76%（15/222），其中绵羊的感染率为7.84%（8/102），山羊的感染率为5.83%（7/120），二者差异不显著（χ2=0.353，P＞0.05）。绵羊的2个养殖场之间感染率分别为12.24%和3.77%，山羊的2个养殖场之间感染率分别为8.33%和3.33%，4个场之间的差异均不显著（χ2=4.444，P＞0.05）（表1）。将阳性样品序列进行Blast比对，发现所有样品的序列与GenBank中序列同源性为100%，共发现3种隐孢子虫感染，分别为C. parvum、C. xiaoi和C. ubiquitum。其中，6个C. parvum样品（Goat-24、Goat-38、Goat-47、Goat-105、Sheep-45、Sheep-74）与KM010266同源性为100%，2个C. parvum样品（Sheep-4、Sheep-73）与KU892568同源性为100%；3个C. xiaoi样品（Goat-32、Goat-46、Goat-119）与GU553017同源性为100%，3个C. xiaoi样品（Sheep-29、Sheep-30、Sheep-32）序列与GenBank中的序列（登录号：GQ337964）同源性为100%；1个C.ubiquitum样品（Sheep-27）与GenBank中的序列（登录号：KY596684）同源性为100%（图2）。在3种感染的隐孢子虫中，C. parvum所占比例最高，达53.33%（8/15）；其次是C. xiaoi，为40.00%（7/15）；C. ubiquitum的比例最低，仅为6.67%（1/15）（表1）。在绵羊养殖场1中，存在3种隐孢子虫感染，养殖场2仅存在C. parvum感染；而2个山羊养殖场均存在C. parvum和C. xiaoi感染，未发现C.ubiquitum感染（表1）。

图1 部分样品actin基因PCR扩增产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis results of actin gene PCR amplification products of partial samples

表1 不同养殖场羊隐孢子虫感染情况Table 1 Prevalence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in different farms

图2 阳性样品与GenBank中的actin基因核苷酸比对结果Fig.2 Alignment results of actin gene between positive samples and GenBank loading sequences

2.3 不同日龄的感染情况 将调查的羊按＜6月龄、6～12月龄和＞12月龄3个年龄段分别进行统计，结果，绵羊感染率最高的年龄段为6～12月龄，达到20.69%（6/29），而＜6月龄和＞12月龄的感染率分别为2.70%（1/37）和2.78%（1/36），不同年龄段之间的感染率差异显著（χ2=9.252，P＜0.05）；山羊感染率最高年龄段为＞12月龄，为10.00%（4/40），其次为6～12月龄，为7.50%（3/40），而＜6月龄的绵羊样品未发现隐孢子虫感染，不同年龄段之间的感染率差异不显著（χ2=3.944，P＞0.05）（表2）。从感染的种类来看，绵羊样品中＜6月龄和＞12月龄均发现1例C. parvum感染，而6～12月龄存在3种隐孢子虫感染；山羊样品中6～12月龄和＞12月龄均存在C.parvum和C. xiaoi感染（表2）。

表2 不同日龄羊隐孢子虫感染情况Table 2 Prevalence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in different age goats and sheep

2.4 隐孢子虫actin基因的系统进化分析 对PCR阳性样品序列和部分GenBank中的序列采用NJ法进行系统发育分析。结果表明，本研究所获得序列分别与GenBank下载的C. parvum、C. xiaoi和C. ubiquitum序列在同一个分支上（图3）。

3 讨论

当前，隐孢子虫病已成为各个国家重要的公共卫生问题，在无有效药物治疗的前提下，及早诊断、提前预防是控制该病的重要途径。羊感染隐孢子虫后，不仅对羊的生长发育造成影响，而且羊感染的隐孢子虫多数是人兽共患虫种，对人群造成潜在威胁。我国关于羊感染隐孢子虫的报道，最早见于卢炳魁等[9]对内蒙古部分地区的检测，随后我国青海、宁夏、贵州、四川、河南、吉林、重庆、安徽、吉林、辽宁、山东、江苏、陕西等省市均有报道，感染率为0%～65%，这些检测绝大多数以常规的镜检为主[10-21]。由于不同种隐孢子虫之间大小差异并不明显，光靠镜检很难鉴定出羊感染的虫种或基因型，很难评估哪些虫种对人类健康存在潜在的威胁，而且常规镜检以人的主观判断为主，容易造成实验误差，这也可能是我国不同地区感染率差异显著的原因之一。本次调查采用分子生物学方法，对山东滕州地区绵羊和山羊的隐孢子虫感染情况进行了调查。结果显示，该地区羊的总感染率为6.76%，其中绵羊的感染率为7.84%，山羊的感染率为5.83%。山羊样品的检测结果，低于Mi等[6]以SSU rRNA为靶基因的18.00%检出率，这种检出率的差异原因可能与所用的靶基因不同，使得PCR方法的灵敏度不同有关。

图3 基于隐孢子虫actin基因的系统进化树分析Fig. 3 Phylogenetic tree of Cryptosporidium spp.constructed based on actin gene

近年来，应用分子生物学检测方法，鉴定隐孢子虫感染的虫种或基因型，得到越来越广泛的应用。应用这些方法，我国很多地区开展了羊源隐孢子虫的分子流行病学调查。调查结果显示，不同地区所感染的优势虫种也有差别。2007年，Karanis等[22]报道青海山羊感染的隐孢子虫为C. xiaoi和1个新基因型，这也是国际上首次报道山羊感染C.xiaoi感染病例；随后报道山羊感染虫种以C. xiaoi为主[6,23,24]；而Wang等[25]对河南和重庆地区山羊隐孢子虫调查发现C. ubiquitum是优势种。绵羊感染情况也相似，C. xiaoi是绵羊感染的优势种[26,27]，而对河南和四川地区研究表明，C. ubiquitum是优势种[28,29]。目前对于隐孢子虫虫种或基因型的鉴定，多数基于SSU rRNA基因进行鉴定，但是，本课题组在进行隐孢子虫分子流行病学调查时，有时会扩增出假阳性样品（未知真核生物）。本试验尝试选取actin基因做为靶基因，对滕州市羊源样品进行了检测。结果发现，C. parvum所占的比例最高（53.33%），其次是C. xiaoi（40.00%），仅发现1例C. ubiquitum，这与之前种型研究结果不一致。检测结果的差异可能和采样的季节、动物的年龄、选取的靶基因不同有关。有研究发现，SSU rRNA基因扩增为阳性的样品，有部分样品actin基因并不能有效扩增[8]，因此我们推测不同靶标基因对同一虫种的扩增效率不同，这还需要应用SSU rRNA对本试验选取的样品进行进一步验证。

从感染的不同日龄来看，本次调查发现绵羊感染率最高的年龄段出现在6～12月龄，C. xiaoi是优势种；而山羊则是＞12月龄感染率最高，＜6月龄的未发现感染，这与之前报道羔羊最易感结果不一致。崔彬等[14]报道2～4月龄山羊感染率最高，陈静等[17]发现2～3月龄感染率最高。检测结果的差异可能和我们所采集羊的年龄段范围偏广、低日龄羊的样品采集偏少有关，具体原因尚需进一步细化羊的年龄段，再次采样验证。

综上所述，本研究以隐孢子虫actin基因为靶基因，对来自滕州市的绵羊和山羊样品进行了检测，总的感染率为6.76%，存在3种隐孢子虫感染，分别是C. parvum、C. xiaoi和C. ubiquitum，其中C. parvum和C. ubiquitum均是人兽共患的虫种，需要引起重视。本研究首次采用分子生物法调查了山东省滕州市不同日龄羊隐孢子虫感染情况和种类，研究结果为科学评估该地区羊隐孢子虫病的风险程度提供依据，也为制定预防和控制羊隐孢子虫病措施提供了参考。