木质纤维原料与纤维素酶相互作用的研究进展

万广聪 贾转 李明富 覃程荣 王双飞 闵斗勇

摘要：阐述木质纤维原料与纤维素酶系统间的相互作用有助于揭示底物物理及化学性能对纤维素酶的抑制机理，提高木质纤维原料的纤维素酶解转化率。本文主要介绍了木质纤维模型物薄膜的制备进展，各种新兴技术在实时观测木质纤维原料与纤维素酶相互作用方面的应用进展以及人们对提高纤维素酶解效率所做的努力，为木质纤维原料的高效利用提供理论支持。

关键词：木质纤维原料；纤维素酶；酶解效率

中图分类号：TS721+1；Q55文献标识码：ADOI：1011981/jissn1000684220180361

收稿日期：20170930

基金项目：中国博士后基金 （2015M570419）；华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室开放基金 （201505SKLPPE） 。

作者简介： 万广聪，男，1990年生；在读硕士研究生；主要研究方向：木质纤维原料高值化利用。

*通信联系人：闵斗勇，教授，博士生导师；主要研究方向：木质纤维原料全组分高值化利用基础研究；Email：mindouyong@gxueducn。随着气候和环境的恶化，人们日益重视人类社会的可持续发展。近年来，利用木质纤维原料生产生物质能源以替代化石能源越来越受到人们的高度关注。与化石能源相比，生物质能源具有可再生、储量大等优势。实现生物质乙醇的工业化生产，可以减轻人类对化石能源的过度依赖[1]。木质纤维原料的主要化学成分包括纤维素、木质素、半纤维素等，它们相互交织形成的复杂空间网状结构是木质纤维原料抵抗降解的天然屏障，使纤维素酶很难降解未经预处理的木质纤维原料。其中，木质素常作为“黏合剂”和“填充剂”填充在胞间层和微纤丝之间，使纤维间粘结更加牢固，从而使植物纤维原料具有更高的机械强度且更难被降解。此外，木质素对纤维素酶的无效吸附是纤维素酶活性降低的主要因素[2]。研究发现，酶解后纤维素酶的回收率低主要是因为纤维素酶不可逆地吸附在木质素表面[3]。探究木质纤维原料性能（如木质素、半纤维素、纤维素的含量及结构、木质素分布等）对纤维素酶酶解的影响机理，有助于寻找更有效的预处理方法来提高木质纤维原料的酶解转化率。

为了提高木质纤维原料的酶解转化率，研究人员已开发出多种预处理方法，通过降低半纤维素或木质素的含量、纤维素的结晶度，增加木质纤维原料表面的孔隙率和比表面积，从而增加酶的可及性。预处理在一定程度上能有效提高木质纤维原料的酶解转化率[4]。由于预处理不能完全脱除木质素，因此木质素对纤维素酶的无效吸附仍然是影响酶解效率的主要因素[5]。在各种预处理方法（包括生物法、化学法和机械法等）日趋成熟的条件下[6]，目前仍然缺乏木质纤维原料与纤维素酶相互作用的基础理论，这将阻碍利用木质纤维原料生产生物质乙醇的产业化应用。

由于木质纤维原料与纤维素酶相互作用的复杂性，目前酶解过程中葡萄糖产量仍然是衡量木质纤维原料酶解效率的重要指标。但这种衡量方法具有较大的局限性，只能研究纤维素酶水解底物的效率，不能研究纤维素酶与底物的相互作用，因而不能系统阐述木质纤维原料结构对纤维素酶的抑制机理。为克服这些局限，研究人员通过制作木质纤维薄膜，利用石英晶体微量天平（QCM）、紫外可见分光光度计、椭圆偏振光谱仪（简称椭圆仪）、原子力显微镜（AFM）等技术探究纤维素酶与木质纤维原料的相互作用，以及纤维素酶对木质纤维原料的水解过程，以揭示木质纤维原料对纤维素酶酶解的各种限制因素，阐述木质纤维原料与纤维素酶的相互作用机理。

1木质纤维薄膜的制备

木质素被认为是抑制木质纤维原料酶解的最主要组分。为了探究木质素对纤维素酶的抑制作用，研究人员开始使用QCM、AFM和椭圆仪等仪器对木质纤维原料与纤维素酶相互作用机理进行研究，而未经处理的木质纤维原料很难在以上仪器进行研究，因此有学者制备了再生单组分或双组分的木质纤维薄膜并用作模型物，以研究木质纤维原料与纤维素酶之间的相互作用。Gunnars等[7]用50% N甲基吗啉N氧化物（NMMO）作为溶剂溶解纤维素，配制成纤维素溶液，利用旋涂法将纤维素附着在SiO2晶片上，成功制备了可吸附在SiO2晶片上且纯度较高的纤维素薄膜，方便利用QCM研究纤维素性能。Falt等[89]对Gunnars在SiO2上旋涂制备纤维素薄膜的方法进行了优化，通过纤维素浓度控制膜厚度，通过溶液的温度控制膜表面粗糙度，成功制得具有较高润胀性能且可利用QCM进行溶胀测量的纤维素薄膜。

纤维素单组分薄膜的成功开发为利用QCM监测纤维素的酶水解过程提供了一个优良的模型物。为了能够更好地了解木质纤维原料酶水解的动态过程和木质素对纤维素酶的抑制机理，需要开发出一种化学结构与原生木质纤维原料相似的模型物。目前，已有研究人员开发出成分更加接近天然木质纤维原料的纤维素木质素双组分薄膜。Hoeger等[10]将三甲基硅烷基纤维素（TMSC）和木质素乙酸酯混合溶解在常规溶剂中，然后旋涂在SiO2晶片上，制得混溶性较好、疏水性较强的纤维素木质素双组分薄膜。MartinSampedro 等[11]利用三乙酸纤维素（CTA）代替TMSC，简化了纤维素木质素双组分薄膜的制备过程，不仅显著降低了实验难度，而且得到了各项性能更加优异的纤维素木质素双组分薄膜。纤维素木质素双组分薄膜的开发加速了对纤维素酶水解的动态研究，但仍然缺乏木质素对纤维素酶抑制机理的研究。为了研究木质素单个变量对纤维素酶解的影響，有学者对木质素单组分薄膜开展了大量研究。Wang等[12]合成了比天然木质素摩尔质量更低、醚键和端基比例更高的木质素薄膜。Pereira等[13]制作了一种可沉积在SiO2晶片上的木质素薄膜；研究发现，木质素的来源和S/G比例等都会显著影响木质素与纤维素酶的相互作用。

模型物薄膜的开发实现了使用先进设备研究木质纤维原料与纤维素酶的相互作用，但模型物薄膜在空间结构和化学成分上都与天然木质纤维原料有一定差别，因此开发制备空间结构与化学成分更加接近天然木质纤维原料的底物模型物薄膜将是今后研究的主要方向。

2新兴技术在研究木质纤维原料酶解过程中的应用

随着底物模型（单组分/双组分木质纤维薄膜）制备方法的完善，研究人员开始利用新兴技术来探究酶与底物的相互作用。目前，用于分析酶处理前后及处理过程中底物的组分及结构变化的常用方法有红外光谱和核磁共振，但这2种方法具有很大局限性，只能提供酶处理前后底物化学结构变化的信息，无法提供酶水解过程的更多信息。通过新兴技术可以观测酶处理前后底物表面结构的变化，揭示酶与底物之间的相互作用规律。本文主要介绍了QCM、紫外可见分光光度计、椭圆仪及AFM在观测酶解过程中木质纤维原料与纤维素酶相互作用的应用进展。除了这些技术，还有学者开发出其他方法，如氚标记法和正交建模法，加深了对木质纤维原料酶解过程的认识。

木质纤维原料与纤维素酶相互作用的研究进展第33卷第3期第33卷第3期木质纤维原料与纤维素酶相互作用的研究进展21QCM

QCM是通过石英晶体器件超高频电阻抗谱、频谱或相位等参数变化对环境介质包括质量、黏弹性、异纳、介电或流变特性等作出相关应答并转换为相应传感检测信号，获取有关目标组分或多元组分体系成分、形状的一维或多维信息，实现对研究对象全面、动态的在线检测技术[14]。因为轻微的质量变化都会引起QCM频率的变化，所以根据QCM频率变化可以计算出纤维素酶在模型物薄膜（底物）表面的附着量以及了解薄膜的酶解程度。Turon等[15]通过水解过程中QCM频率和能量耗散变化探究了纤维素酶水解纤维素薄膜的酶解动力学；研究发现，QCM频率变化和能量耗散是由酶解过程中膜的质量和形态变化而引起的。Kumagai等[16]利用QCM研究了木质纤维素纳米纤丝薄膜（LCNF）的酶解过程；研究发现，LCNF表面上存在的半纤维素和木质素使得QCM的特征频率和能量耗散变化不同于QCM在纯纤维素中的特征频率和能量耗散变化。

底物模型物薄膜的黏弹性变化也会引起QCM频率的变化。Josefsson等[17]利用QCM研究了真菌纤维素酶对纳米厚度纤维素膜的水解过程；研究发现，内切葡聚糖酶不仅可使纤维素产生新的端基，而且会引起纤维素膜软化和润胀，从而使纤维素膜降解。利用QCM除了可以监测底物的微观变化外，还可以监测酶的活性。Zhou等[18]建立关于纤维素酶吸附降解机理的动力学模型，量化环境变化对纤维素酶活性的影响，探究了酶解过程中纤维素酶活性的变化。Ahola等[19]利用天然纤维素纳米纤丝薄膜研究了纤维素酶的酶解动力学和活性，利用QCM监测不同酶浓度和温度下晶体的频率和能量耗散变化；研究发现，纤维素酶活性受纤维素结晶度的影响显著。Cheng等[20]利用QCM研究了内切葡聚糖酶与无定形纤维素膜的相互作用；研究结果表明，各种内切葡聚糖酶在无定形纤维素薄膜中都表现出较高活性。

此外，在研究纤维素酶酶解底物膜系统的动态过程中，利用QCM可实时监测酶与底物模型物相互作用的整个过程。Selig等[21]利用QCM研究了多糖单加氧酶CelS2（ScLPMO10C）与纤维素的相互作用；研究发现，减少CelS2与纤维素的无效吸附、增加CelS2在纤维素表面的流动性可以增强纤维二糖水解酶的活性。MartinSampedro等[11]利用QCM研究了纤维二糖水解酶（CBH I 和EG I）酶解纤维素木质素双组分薄膜的动态过程；研究发现，CBH I与纤维素的亲和力高于木质素；EG I可随机切割纤维素非结晶位点处的糖苷键，EG I通过降低纤维素聚合度使纤维素产生新端基，引起纤维素润胀。Pfeiffer等[22]开发了一种与木质素化学结构相似的均匀木质素薄膜，利用QCM实时测量木质素薄膜表面上纤维素酶的吸附量，描述了纤维二糖水解酶Cel7B与木质素结合的动力学机理。

22紫外可见分光光度计

紫外可见分光光度计是利用紫外吸收光谱对物质进行定性或定量的分析方法，不需要对试样进行分离，可以直接分析试样的不同组分。紫外可见分光光度法通过双波长或光谱衍生法测量木质纤维原料在酶解过程中吸附纤维素酶的质量。酶解过程中，紫外可见分光光度计能够快速分辨纤维素酶和木质纤维原料，因此能够测量出纤维素酶在底物表面的吸附量。在研究酶水解过程中，通过紫外可见分光光度计可以清晰地观察酶解的动态过程[23]。Liu等[24]用原位紫外可见分光光度法了解了酶解过程中木质纤维底物吸附纤维素酶的情况。利用双波长法和光谱衍生法，可校正木质素和固体颗粒对内切葡聚糖酶吸附光谱的干扰，实现纤维素酶吸附到木质纤维底物上的原位测量。紫外可见分光光度法只能通过测量纤维素酶在底物上的吸附量来观察酶解的动态过程，但对其作用机理的揭示仍有局限性。目前，还没有研究人员利用紫外可见分光光度计观察膜系统酶水解过程进行深入研究。

23AFM

AFM通过检测样品表面与一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构与性质。将对微弱力极敏感的微悬臂一端固定，另一端的微小針尖接近样品时会产生相互作用力，作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。扫描样品时，利用传感器检测这些变化，就可获得作用力分布信息，从而以纳米级分辨率获得样品表面形貌结构及粗糙度等信息[25]。因此，利用AFM可检测纤维素木质素双组分薄膜的相分离程度，从而了解纤维素与木质素的混融程度，探究纤维素及木质素的结构和溶剂对纤维素木质素双组分薄膜的影响。除了观测底物表面形貌，利用AFM还可观察纤维素酶酶解的动态过程。利用AFM研究酶解过程时，先需将酶固定在AFM探针尖端，为了既能将酶固定在AFM探针尖端又保留酶活性，专家学者做了大量的研究。Amarante等[26]运用粗粒度模型来确定固定在AFM尖端酶的数量和与底物相互作用的活性位点的平均数量。Casero等[27]总结了利用 AFM、扫描电化学显微镜（SECM）和QCM进行不同实例应用的研究，以及详细阐述了生物酶在电极表面上的固定过程。随着酶固定方法的成熟，利用AFM观测酶解过程变得比较容易。Zhang等[28]利用AFM成像功能实时观测酶在预处理植物细胞壁纤维素的酶解过程；研究发现，酶的作用模式取决于预处理底物裂纹的大小：裂纹小，只有2个裂纹之间的纤维素会被纤维素酶水解；裂纹大，裂纹区大量的纤维素会被纤维素酶水解；研究还发现，CBH I和β葡糖苷酶的组合与纤维素复合酶有相似的水解能力。利用CBH I和β葡糖苷酶代替纤维素复合酶，可降低生物质乙醇制备时的生物酶成本。Igarashi等[29]通过AFM实时观察纤维二糖水解酶Cel7A降解结晶纤维素的动态过程并发现，Cel7A分子会沿着结晶纤维素表面单向移动，但Cel7A分子移动到某一点时会集体停止，这个发现表明，纤维素结晶区会阻碍Cel7A的移动，降低Cel7A的活性。。

24椭圆仪

椭圆仪是一种研究薄膜表面及固体光学性质的仪器，通过分析光在样品上反射的偏振状态变化，获取物质的光学性能。这种分析手段精确度高，且不损伤样品本身，属无损测量[30]。椭圆仪可用于研究旋涂技术制备的纤维素薄膜模型物的酶解过程。酶解前，用椭圆仪、化学分析电子光谱（ESCA）和AFM对纤维素薄膜结构进行表征。添加生物酶后，利用椭圆光度法量化纤维素酶在纤维素膜基底的吸附过程和表面酶解过程，实现对完整酶解过程的观察和表征[31]。Maurer等[32]证明了用椭圆光度法定量分析纖维素酶在纤维素膜吸附和活性的有效性，利用椭圆光度法研究了生物酶的结构和活性对纤维素底物降解的影响；研究发现，碳水化合物结合模块（CBM）对纤维素底物的吸附和降解起主要作用，CBM的去除会导致纤维素酶对纤维素的吸附能力和纤维素降解速率的降低，还会导致纤维素酶对pH值依赖性的降低。

25其他方法

除了运用上述技术外，一些学者也尝试利用更加简单直观的方法进行纤维素酶解研究。其中，氚标记法和正交建模法在酶水解过程的研究中取得了新进展。为了探究木质素对纤维素酶的吸附作用，有学者利用氚化CBH I和内切葡聚糖酶（EG II）的催化结构域作为示踪剂来确定游离蛋白浓度，从而确定木质素对酶的吸附能力。Palonen等[3334]使用氚标记法比较了CBH I和EG II 2种纯化纤维素酶在蒸汽预处理软木（SPS）和木质素上的吸附效果；研究发现，CBH I对SPS的亲和力比EG II高，EG II的催化结构域对碱性分离的木质素具有更高的亲和力，而CBH I的催化结构域对任何木质素都没有亲和力。实验结果还表明，纤维素结合结构域在纤维素酶与木质素的非特异性结合中的作用显著。Lebaz等[35]直接将正交建模方法应用到纤维素酶解过程中EG和CBH活性的研究；研究结果发现，EG和CBH具有协同作用，纤维二糖和葡萄糖的积累会显著降低酶活性。

QCM、AFM、紫外可见分光光度计、椭圆仪和其他方法在研究纤维素酶与木质纤维原料相互作用的过程中发挥至关重要的作用。大量的实例研究表明，不同的酶水解纤维素的方式以及对木质素的耐受性差异很大。随着这些技术的发展以及它们与其他技术的结合使用，将有可能彻底揭开纤维素酶与木质纤维原料相互作用机理的神秘面纱。

3提高木质纤维原料酶解效率的方法

31预处理

人们对木质纤维原料性能、木质纤维原料与纤维素酶的相互作用进行了大量研究。研究发现，木质素、纤维素、半纤维素组成的三维立体网络结构使木质纤维原料具有优异的机械强度而难被降解。预处理可以破坏木质纤维原料的网络结构，降低纤维素结晶度和聚合度，脱除部分半纤维素和木质素，有效提高酶的水解效率。预处理方法可分为物理法、物理化学法、化学法和生物法。

物理法的主要方式是机械粉碎，通过物理法可以增大木质纤维原料的比表面积和孔径，降低纤维素结晶度和聚合度。Sidiras等[36]研究发现，球磨可以降低纤维素结晶度使纤维素更容易被酶水解。Sun等[37]研究发现，在球磨过程中增加球的个数、提高运转速度和延长球磨时间均可显著提高纤维素的酶水解程度，较高处理强度下，纤维素几乎可以完全被酶水解。除了机械粉碎外，照射γ射线、电子束和微波均可提高木质纤维原料的酶水解效率。辐射照射可使纤维脆性增大，纤维素大分子降解成小分子，使寡糖降解为纤维二糖，甚至可以破坏寡糖和葡萄糖的环结构[38]。虽然物理法可以有效提高纤维素的酶水解效率，但能源消耗大，不适合大规模的工业化生产。

物理化学法是指结合物理和化学过程的预处理方法，主要方式是蒸汽爆破。将木质纤维原料在160℃蒸汽爆破下高温处理10～30 min，然后迅速结束反应，汽爆时压力突然降低，使木质纤维原料体积迅速增大，破坏原料原有结构，增大其比表面积和表面孔径，从而有效脱除半纤维素，使纤维素与木质素分离，提高糖转化率[39]。Varga等[40]用蒸汽爆破法处理玉米秸秆；研究发现，蒸汽爆破预处理可以去除玉米秸秆大部分半纤维素并使纤维素更易被酶降解。

化学法是使用酸碱等化学药品对原料进行处理，以有效地破坏木质纤维原料的致密结构，脱除木质素和半纤维素，提高纤维素的酶解转化率[41]。谢土均等[42]通过甘蔗渣活性氧固体碱蒸煮脱木素实验发现，当蒸煮温度超过140℃时木素会被大量脱除，最佳保温时间为80 min。郑杰等[43]通过绿液预处理杨木实验发现，绿液预处理可脱除大量木质素，木质素的脱除有利于提高纤维素的酶转化率。

生物法是使用能够分离降解木质素的菌类对木质纤维原料中木质素进行有效的生物降解，从而提高木质纤维原料的酶解效率。Taniguchi等[44]用4种白腐真菌（黄孢原毛平革菌、变色栓菌、平头孢霉和平菇）处理稻草发现，4种白腐真菌都可以有效地降解木质素，经白腐真菌预处理后稻草的纤维素酶水解转化率明显高于未经预处理的稻草。

32酶解促进剂

虽然预处理能够破坏木质纤维原料结构、降低半纤维素和木质素含量，但是存在能源消耗大、污染环境的弊端。此外，预处理不能完全脱除木质素，木质素对酶的空间阻碍和无效吸附的影响依然存在，所以预处理后的酶水解效果仍不能达到期望值。多年来，研究人员一直致力于进一步提高预处理后木质纤维原料酶解效率的研究。因此，研究人员尝试在酶解过程中使用添加剂如表面活性剂（吐温80）、非水解蛋白（牛血清蛋白BSA）和聚合物（聚乙二醇PEG）来提高酶解效率。研究发现，一些添加剂的使用能够降低木质素对纤维素酶的吸附，提高纤维素酶的活性和稳定性。Méndez等[45]在PEG和BSA等添加剂对酶水解性能影响的实验中发现，添加剂可与纤维素酶和半纤维素酶发生协同作用，从而有效提高酶的水解性能，但添加剂不是对所有的酶都有促进作用。Li等[46]在竹子的酶解实验过程中分别添加BSA、PEG和吐温80发现，纤维素和聚木糖的酶解转化率得到提高。Wang等[47]在纤维素酶水解滤纸的实验中添加了BSA发现，添加BSA可以提高酶活性，纤维素的糖转化率从75%提高到90%以上。Toyosawa等[48]研究了在微晶纤维素和蒸汽爆破蔗渣（SEB）的酶解过程中加入非催化蛋白质对纤维素酶组分在底物表面的吸附和解吸行为的影响；结果发现，加入非催化蛋白质增强了SEB的酶解效率。加入非催化蛋白质可降低木质素对CBH I、EGI和β葡糖苷酶的无效吸附，从而提高纤维素的酶解转化率。

33纤维素结构优化和纤维素酶基因改造

除了使用添加剂外，对酶解底物进行有效的修饰也可达到提高糖转化率的目的，例如从真菌中提炼的水解结晶纤维素的纤维素酶都具有相同的结构（催化结构域和碳水化合物结合结构域），在酶解的开始阶段，纤维素酶的碳水化合物结合结构域会与纤维素疏水基团结合，然后催化结构域将逐步催化降解纤维素[49]，因此通过增加纤维素疏水结构可提高酶解效率。Shibafuji等[50]利用CBH I水解具有不同晶型的木质纤维原料底物；研究发现，优化酶浓度和增加结晶纤维素表面的疏水性基团，可有效提高CBH I酶解木质纤维原料的效率。随着科学技术的发展，各个学科之间联系越来越密切，有学者开始运用基因技术对纤维素酶进行改造，通过提高酶的性能，使酶的水解效率得到提高。Pereira等[51]对内切葡聚糖酶Tm_Cel5A进行基因改造，利用大肠杆菌菌株生产内切葡聚糖酶Tm_Cel5A（晶型I和II）；结果发现，基因改造提高了Tm_Cel5A的热稳定性，使其在高温下也具有高催化活性。Voutilainen等[52]利用基因改造嗜热真菌的纤维二糖水解酶Cel7A；研究发现，基团改造后的嗜热乳杆菌Cel7A 在45℃下对木质纤维原料底物表现出最高活性，金黄色嗜热子囊菌Cel7A在70℃下对微晶纤维素的水解效率最高。

4结语及展望

生物酶系统水解木质纤维原料的动态过程十分复杂，制备木质纤维薄膜有助于人们更好地研究木质纤维原料各个组分对酶的影响。由于木质纤维薄膜制备方法的限制，薄膜的物理及化学性能与天然木质纤维原料仍有一定的差距，这些势必影响实验结果的准确性，但其仍然是生物质精炼领域研究的一個创举。石英晶体微量天平（QCM）和原子力显微镜（AFM）是研究木质纤维原料与生物酶相互作用最重要的技术手段，利用QCM能够实时监测酶水解动态过程，利用AFM可直接观察原料表面的形态变化。此外，紫外可见分光光计、椭圆仪等仪器的应用可更加全面地探究木质纤维原料酶水解动态过程。今后各种技术综合利用以及新技术的开发，将会对木质纤维原料与纤维素酶相互作用机理有更加深入的研究；从而提高木质纤维原料的酶解效率，木质纤维原料生产生物质乙醇将会实现工业化生产，以替代化石能源，为人类社会的长足发展奠定基础。

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Research Progress in Interaction Mechanism between Lignocellulosic Material and Cellulase

WAN Guangcong1，2JIA Zhuan1，2LI Mingfu1，2QIN Chengrong1，2WANG Shuangfei1，2MIN Douyong1，2，*

（1. College of Light Industry and Food Engineering， Guangxi University， Nanning， Guangxi Zhuang Autonomous Region， 530004；

2. Guangxi Key Laboratory of Clean Pulp & Papermaking and Pollution Control， Nanning， Guangxi Zhuang Autonomous Region， 530004）

（*Email： mindouyong@gxu.edu.cn）

Abstract：The observation of the interaction between lignocelulosic material and cellulase can help to elucidate its inhibiting mechanism on enzymes. This paper mainly introduced the progress in the preparation of biomass model film， the application progress of various emerging technologies in realtime observation of the interaction between lignocellulosic material and cellulase， and the efforts made to improve the enzymatic efficiency. Its hoped to provide theoretical support for the efficient utilization of wood fiber raw materials.

Keywords：lignocellulosic material； cellulase； enzymatic efficiency

（責任编辑：陈丽卿）数字出版日期：20180608；数字出版网址：http：//knscnkinet/kcms/detail/112075TS201806071128002html