传统蒙药苏木六味汤散的质量标准

2018-09-10王美丽戴丽丽春玲田香白玉霞

世界中医药 2018年2期

王美丽戴丽丽春玲田香白玉霞

摘要目的：建立蒙药苏木六味汤散的质量标准。方法：采用薄层色谱（TLC）定性鉴别制剂中苏木，木香，槟榔，高良姜等；以高效液相色谱法（HPLC）测定苏木中巴西苏木素和原苏木素B的含量：色谱柱Topsil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（11∶89），检测波长为285 nm，流速1 mL/min，柱温30 ℃，进样量为10 μL。结果：苏木，木香，槟榔，高良姜TLC图斑点清晰、专属性强；巴西苏木素与原苏木素B的进样量分别在112.875～564.375 ng、71.975～359.875 ng范围内与各自峰面积呈良好的线性关系（r分别为0.9997和0.999 9）。精密度、稳定性、重复性实验RSD%均小2.0%，加样回收率分别为99.24%、98.06%，RSD分别为0.12%、0.93%。结论：所建立的定性鉴别方法专属性强、重复性好、定量方法简便、准确、可靠，可用于传统蒙药苏木六味汤散的质量控制。

关键词蒙药苏木六味汤散；薄层色谱法；高效液相色谱法；巴西苏木素；原苏木素B

Abstract Objective：To establish the quality standard of traditional Mongolian Sumu Liuwei Tangsan. Methods：Lignum Sappan， Radix Aucklandiae， Semen Arecae and Rhizoma Alpiniae Officinarum were identified by TLC qualitatively. The content of brazilin and protosappanin B in Lignum Sappan was determined by HPLC. The separation was performed on Topsil C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with mobile phase consisted of acetonitrile-water （11∶89） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 285 nm. The column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Results：The TLC spots of Lignum Sappan， Radix Aucklandiae， Semen Arecae and Rhizoma Alpiniae Officinarum were clear and specific. The linear range was 112.875-564.375 ng for brazilin （r=0.9997） and 71.975-359.875 ng for protosappanin B （r=0.9999） respectively. The RSDs of precision， stability and repeatability tests were no more than 2%. The average recoveries were respectively 99.24 % （RSD=0.12 %， n=6） and 98.06 % （RSD=0.93 %， n=6）. Conclusion：The qualitative identification is specific and reproducible， and quantitative method is simple， accurate and reliable， which can be used for the quality control of traditional medicine Sumu Liuwei Tangsan.

Key Words Mongolian medicine Sumu Liuwei Tangsan； TLC； HPLC； Brazilin； Protosappanin B

中圖分类号：R282.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.056

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC—20ATvp型HPLC仪，含SPD-M20Avp型检测器、SHIMADZU-VP色谱工作站（日本岛津公司）；AUW220型电子天平（日本岛津公司）；KQ-600DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AUY120型电子天平（广州市新英电器有限公司）；HH-S26S数显恒温水浴锅（上海跃进医疗机械厂）。WS701型红外线快速干燥器（上海锦州屏仪器仪表有限公司通州分公司）；DHG9070型电热恒温鼓风干燥箱（上海精密宏实验设备有限公司）；ZF-I型三用紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；紫外分析仪JY02S型（北京君意东方电泳设备有限公司）。

1.2 试剂

巴西苏木素对照品（中国食品药品检定所，供含量测定用，纯度>99%，批号：111881-201302）；原苏木素B对照品（中国食品药品检定所，供含量测定用，纯度>99%，批号：111882-201302）；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3 分析样品

苏木六味汤散是内蒙古民族大学附属医院（批号：20150504、20140417；规格：15 g）、内蒙古国际蒙医医院（批号：20141115；规格：3 g）、通辽市蒙医研究所（批号：20140952；规格：15 g）、包头市蒙医中医医院（批号：412183；规格：21 g）等医院的制剂。

2 方法与结果

2.1 苏木的TLC鉴别[13] 取样品1 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取苏木对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取巴西苏木素和原苏木素B对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液。照TLC试验，取以上溶液各2 μL，各自点在相同硅胶GF254板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸=8∶4∶1为展开剂，展开，晾干，即刻置于干燥器内12 h后置紫外灯（254 nm）下检视。样品的色谱图中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图1。

2.2 高良姜的TLC鉴别[13] 取样品1 g，加甲醇20 mL，超声处理20 min，过滤，取续滤液作为样品溶液[13]。另取高良姜对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取高良姜素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液。照TLC实验，吸取上述溶液各2 μL，各自点在相同硅胶薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯-甲醇-冰乙酸10∶1∶1∶0.5上层为展开剂，并展开2次，再晾干，喷10% CH3CH2OH·H2SO4溶液显色。样品色谱图中，与对照品和对照药材相应的位置上，显出颜色相同的斑点。见图2。

2.3 木香的TLC鉴别取样品1.5 g，加CH3OH 15 mL，超声30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，即得滤液作为样品溶液。再取去氢木香内酯、木香烃内酯对照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶[13]。吸取上述溶液各5 μL，各自点在相同硅胶G板上，以15∶5∶1比例的环己烷-甲酸乙酯-甲酸作为展开剂，预饱和25 min，展开，当展距约15 cm时取出，晾干。分别喷以5%的香草醛硫酸溶液，于105 ℃加热至2～3 min斑点清楚，在日光下检识。样品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，结果见图3。

图2 高良姜薄层色谱鉴别注：1～5供试品；6高良姜对照药材；7高良姜对照品；8阴性对照

2.4 槟榔的TLC鉴别取样品2 g，加浓氨试液适量润湿，加三氯甲烷80 mL，回流提取30 min，过滤，滤液挥干，残渣加甲醇0.5 mL，使溶解，作为供试品溶液[13]。另取槟榔对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，置氨蒸气预报和的展开缸内，以环己烷-乙酸乙酯-浓氨试液8∶7∶0.2为展开剂，展开，取出晾干，分别置于碘缸中熏至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图4。

2.5 苏木中巴西苏木素和原苏木素B含量的测定

2.5.1 色谱条件色谱柱：Topsil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（11∶89）；流速：1.0 mL/min；检测波长：285 nm；柱温：30 ℃；进样量为10 μL。

2.5.2 溶液的配制 1）对照品溶液的制备：分别精密称取巴西苏木素与原苏木素B对照品3.01 mg和3.03 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.301 mg/mL巴西苏木素和0.303 mg/mL原苏木素B的对照品溶液。2）混合对照品溶液的制备：取上述巴西苏木素对照品溶液（0.301 mg/mL）和原苏木素B对照品溶液（0.303 mg/mL）再分别精密吸取1.5 mL和0.95 mL至10 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度。制成每1 mL分别含巴西苏木素45.15 μg和原苏木素B 28.79 μg的混合对照品溶液。3）供试品溶液的制备：取苏木六味汤散约1.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入80%的甲醇50 mL，称定重量加热回流20 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.5.3 系统适用性试验精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按色谱条件进样测定，记录色谱。见图5、6。由图可知，供试品溶液与混合对照品溶液均在相同保留时间处出现巴西苏木素和原苏木素B的吸收峰，且与其他组分峰达到基线分离，分离度均大于1.5。理论板数按原苏木素B峰计算应不低于3 000。

2.6 线性关系考察精密吸取上述混合对照品溶液（1 mL分别含巴西苏木素的浓度为52.8 μg、原苏木素B 74.2 μg）2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 μL注入高效液相色谱仪进行测定。按上述色谱条件测定其峰面积，以进样量（xng）横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程分别为：Y巴西苏木素=2 000 000X-8 636.2（r=0.999 7），Y原苏木素B=1 000 000X-2 742.5（r=0.999 9）。

结果是巴西苏木素和原苏木素B的进样量分别在112.875～564.375 ng、71.975～359.875 ng范围内与各自峰面积呈良好的线性关系。见圖7，图8。

2.7 精密度试验称取苏木六味汤散（批号：412183、包头市蒙医中医医院提供）约1.5 g，精密称定，按供试品制备方法制备待测溶液，再按“2.5.1”项下色谱条件连续进样5次，记录峰面积。

结果是巴西苏木素和原苏木素B的峰面积的RSD分别为0.49%、0.49%，表明仪器精密度良好。见表1。

2.8 稳定性试验取苏木六味汤散（批号：20140417，内蒙古民族大学附属医院提供）约1.5 g，精密称定，按供试品制备方法制备待测溶液，分别于室温下放置2，4，6，8，10，12 h，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。

结果是巴西苏木素和原苏木素B的峰面积的RSD分别为1.24%，0.59%。表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。见表2。

2.9 重复性试验称取苏木六味汤散（批号：412183，包头市蒙医中医医院提供）约1.5 g，共6份，分别制备供试品溶液，再按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，平行测定6次，记录峰面积，计算样品含量。

结果是巴西苏木素和原苏木素B峰面积的RSD分别为1.97%、1.12%（n=6），表明该方法重复性良好。见表3。

2.10 加样回收率试验分别取已知含量的苏木六味汤散0.75 g，共6份，精密称定。精密吸取每份适量加巴西苏木素和原苏木素B的对照品，制备供试品溶液。再按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。

结果是西苏木素和原苏木素B的平均回收率和RSD分别为99.24%、0.12%和98.06%、0.93%。见表4。

2.10 样品测定取六批苏木六味汤散约1.5 g，精密称定，每批制备3份，再按“2.5.1”项下色谱条件进样10 μL，每份测定3次，并计算样品的含量。

结果是民大附院（20140417）、民大附院（20150504）、国际蒙医医院、包头中蒙医医院通辽蒙研所的巴西苏木素和原苏木素B平均含量和RSD见表5。

3 讨论

蒙药苏木六味汤由苏木（Caesalpinia sappan L）、槟榔（Areca catechu L）、高良姜（Alpinia officnarum Hance）、草果（Amomum tsao-Ko Grevost et Lemaire）、木香（Aucklandia Lappa Decne）、白豆蔻（Amomum Kravanh Pirre ex Gagnep）组成，收载于《内蒙古蒙成药标准》[1]和《中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》[2]（1998年版）中。具有祛“巴达干·赫依”，行血化瘀功能，临床主要用于肾寒，腰腿疼痛，妇女痛经，血瘀闭经等症，是蒙医临床常用药之一。虽然已收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》（1998年版）中，但原标准中仅有处方、制法、性状、检查（散剂项下）和功能主治、用法用量等项；没有鉴别项和含量测定项内容，无法对该制剂进行质量控制。为了能够有效地控制该药的质量，保证临床疗效，有必要对其进行系统的质量标准研究，提升其原有的标准。李争春等[3]研究苏木中，初步确定了16种化合物，其中的主要成分有槲皮素、巴西苏木素、异甘草素、原苏木素B、brazil A、3′-去氧苏木醇、4-O-hydroxybrazilin、苏木查耳酮、（αS）-α，2′，4，4′-tetrahydroxy dihydro-chalcone等，其中巴西苏木素是苏木水提物的主要化学成分。苏木主要成分为酚类化合物。分别为苏木酮A，3-去氧苏木酮B，苏木查尔酮，3-去氧苏木查尔酮，原苏木素B，（-）-丁香树脂酚和表苏木醇等成分。近年研究表明苏木除传统功效外，还有新的药理活性，如抗肿瘤、抗氧化作用等[4]。巴西苏木红素又名苏木红素（brazilein），是我国常用中药材苏木（又名苏方木，苏枋，赤木，红柴，戈梅芳）中主要活性成分巴西苏木素的氧化产物[5]。目前酚类物质是苏木中公认的活性成分，主要包括高异黄酮、苏木素、原苏木素、苏木查耳酮及苯丙素类，且发现苏木种子中含有大量的卡山烷型二萜[6]。苏木的化学成分主要包括高异黄酮、查尔酮和苯并环氧庚烷等。在后续的实验中，又分离得到10个化合物，分别鉴定（-）-5-O-methyllatifolin（1）、（-）-dalbergiphenol（2）、（-）-latifolin（3）、3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂醛（4）、6，4′-二羟基-7-甲氧基-黄烷酮（5）、（+）-南烛木树脂酚（6）、3，7-二羟基色原酮（7）、3′-O-甲氧基巴西苏木素（8）、3′-O-甲基苏木醇（9）以及3′-O-去氧苏木醇（10）。这10个化合物按其结构类型可分为新黄酮类（1～3），肉桂醛类（4），黄烷酮类（5），木脂素类（6），色原酮类（7）和高异黄酮类（8～10），其中化合物1～5系首次从该属植物中分离得到[7]。苏复宁洗液（冻干）是以我国传统中药苏木经提取制备成的一种用于预防膀胱癌术后复发的中药制剂，为桔红色无定形粉末或疏松固体状物，该制剂对膀胱肿瘤细胞有显著的杀伤作用，具有抗癌活性高、毒性小、安全有效等诸多优点[8]。苏木提取物作用后，肝癌细胞内PCNA平均表达与其对照组比较明显减小，实验结果表明苏木提取物对肿瘤细胞的增殖有良好的抑制作用[9]。苏木粗提物对多种肿瘤细胞均能产生显著的抑制作用，能通过诱导人卵巢癌细胞Skov3产生凋亡[10]。木香为菊科植物木香（Auxklandia lappa Dencne.）的干燥根。木香中主要代表性成分为木香烃内酯和去氢木香内酯，该类成分具有松弛平滑肌作用。木香烃内酯还具有抑制溃疡作用[11]。去氢木香内酯是菊科植物木香干燥根的活性成分。其具有很好的抗癌、抗菌、抑制胃溃疡、增加胃肠蠕动等作用。目前，木香烃内酯（CT）主要通过影响肿瘤细胞的细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、抑制端粒酶活性而抗肿瘤，是否存在其他方面的机制还有待研究。同时，有关CT对正常细胞毒性实验研究较少，仅少量文献表明其细胞毒性较低，如果CT的毒理活性低，将可能具有比其他抗肿瘤药物更大的临床应用价值[12]。槟榔为棕榈科植物槟榔（Areca catechu L.）的干燥成熟种子[13]。棋榔辛、苦、温，归胃、大肠经，具有杀虫、消积、行水、降气、截拒的功效，主要用于绦虫病、蛔虫病、姜片虫病、虫积腹痛、积滞湾、里急后重、水肿脚气、拒疾。历代本草记载，在使用本药时，有生、熟之分，“急治生用，经火则无力”。现代药理研宄表明，槟榔具有驱虫杀虫、促胃肠运动、抗菌、抗抑郁、抗氧化等作用，槟榔生用主要用于杀虫；炒制后主要用于消积导滞[14]。槟榔种子含总生物碱0.3%～0.6%，主要为槟榔碱，并含有少量槟榔次碱、去甲基槟榔碱、去甲基槟榔次碱、异去甲基槟榔次碱、槟榔副碱及高槟榔碱等，均与鞣酸结合存在。还含有鞣质、脂肪、甘露醇、半乳糖、蔗糖、α-儿茶精、表儿茶精、无色花青素、槟榔红色素、皂苷及多种原矢车菊素的二聚体、三聚体、四聚体等。所含脂肪酸的组成为：月桂酸19.5%、肉豆蔻酸46.2%、棕榈酸12.7%、硬脂酸1.6%、癸酸0.3%、油酸6.2%、亚油酸5.4%、十二碳酸0.3%、十四碳烯酸7.2%，又含氨基酸，其中脯氨酸占15%以上[15]。目前对槟榔化学成分的研究集中在槟榔碱[16]。大量实验研究表明槟榔中主要有4种生物碱，分别是槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱、去甲基槟榔次碱；后来研究人员又发现了异去甲基槟榔次碱、高槟榔碱。其他有效成分还有槟榔多酚，总黄酮、槟榔油等[17]。采用硅胶柱色谱和Sephadex LH-20等分离方法，对马槟榔Capparis masaikai果实的化学成分进行分离纯化，依据理化性质及波谱数据分析进行结构鉴定，从中分离鉴定了10个单体化合物，分别为：杜仲树脂酚（1）、erythro-guaiacylglycerol-β-O-4′-sinapyl ether（2）、hedyotol C（3）、hedyotisol A（4）、hedyotisol B（5）、ozoroalide（6）、5α，6α-epoxy-3β-hydroxyergosta-22-ene-7-one（7）、松柏醛（8）、3-羟基-5-（对羟基苯基）戊酸（9）、β-hydroxypro-piovanillone（10）。分离得到的化合物结构类型包括木脂素、大环内酯、甾醇及酚类。化合物1～10为首次从该植物中分离，其中1～7为首次从该属植物中分离得到[18]。槟榔也具有口腔细胞毒性、生殖细胞毒性、肝细胞毒性、免疫细胞毒性[19]。高良姜为姜科植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根茎。根茎含有黄酮类、揮发油、甾醇类化合物，以及鞣质、淀粉、脂肪及微量元素等化学成分，其中的黄酮类成分为其有效成分之一。目前己从其药材中分离鉴定了几十种化合物[20]。草果为姜科植物草果（Amomum tsao-ko Grevost et Lemaire）的干燥成熟果实。临床常以炮制品入药，炮制的方法历代本草均有记载。然而有关炮制品的成分及炮制机理的研究较少[21]。目前国内外学者主要集中于草果挥发油成分的研究，他们主要对不同产地、不同提取方法（水蒸气蒸馏法、微波萃取技术等）以及草果全株各部位的挥发油进行提取，并对其化学成分进行了比较分析[22]。草果中含有挥发油，油中含α、β一旅烯，1，8一按油素，对一聚伞花素，壬醛，癸醛，芳樟醇，樟脑，α一松油醇，香叶醇，草果酮，橙花叔醇等。尚含Zn、Cu、Fe、Ni、Mn、Co等无机元素[23]。草果具有调节胃肠功能、降脂减肥、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、防霉和抗炎镇痛等作用[24]。在高良姜叶的甲醇提取液中共鉴定出分属于两类成分的16个化合物，其中黄酮类物质白杨素、乔松素、杨芽黄素、芹菜素、高良姜素、高良姜素-3-O-甲醚、金合欢素、山柰酚、山柰素、槲皮素、异鼠李素、芦丁。二芳基庚烷类成分包括益智酮甲、益智醇、六氢姜黄素和hannokinol[25]。白豆蔻为姜科植物白豆蔻（Amomun kravanh Pierre ex Gagnep.）或爪哇白豆蔻（Amomum compactum Soland ex Maton）的干燥果实[26]。含有主要成分1，8-桉叶油素及α，β-蒎烯、α-松油醇、松油醇-4、芳樟醇[27]。白豆蔻精油的化学成分主要是由单萜烯类化合物、倍半萜烯类化合物以及萜烯类氧化物构成的，并且以前两类化合物占大多数。无论任何产地的白豆蔻精油，均以桉油精为含量最高的化学成分[28]。白豆蔻属名贵中药材之一，始载于唐代《开元本草》，又名白豆寇、白寇仁，性辛、温，入脾、胃、肺经，为姜科植物白豆范口口或爪哇白豆范的干燥成熟果实，具有芳香化湿、健胃止呕、抑菌防腐之功效。其主要药效成分为按油精，起解热、消炎、抗菌的作用。白豆蔻是三仁汤的主要组方药材之一，临床上多配伍使用，主治呕恶欲吐、胃院胀满、妊娠呕吐、口臭等症[29]。

方中苏木、高良姜、木香、槟榔的薄层色谱鉴别鉴了2015年版《中华人民共和国药典》方法，展开剂比例做了适当调整，结果均能达到良好分离，斑点清晰，重复性好；结果表明，该方法简便、斑点清晰可以作为定性鉴别和检查来控制药品的质量。

通过对苏木中巴西苏木素和原苏木素B高效液相色谱分析，在285 nm处有较高吸收，为方便检验，选择检测波长为285 nm，在285 nm处测定峰面积响应及线性良好。

对流动相进行了优选，包括不同比例的甲醇-水，乙腈-水等流动相系统，最终选用乙腈-水溶液（11∶89）为流动相，巴西苏木素和原苏木素B的色谱峰型好，保留时间适宜，分离效果较好。

参考文献

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